Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Methoden 37
4.3.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Zusammensetzung für zwei SDS-PAGE-Gele nach Laemmli:
12 % Trenngel Sammelgel
3,3 ml Acrylamid (10% T; 2,6 % C 1 ) 0,65 ml Acrylamid (10% T; 2,6 % C)
4,0 ml ddH 2 O 3 ml ddH 2 O
2,5 ml Tris/HCl 1,5 M pH 8,8 25 µl SDS 20 %
50 µl SDS 20 % 1,25 ml Tris/HCl 0,5 M pH 6,8
50 µl APS 10 % 32,5 µl APS 10 %, BPB
5 µl TEMED 0,05 % 6,25 µl TEMED 0,05 %
Probenvorbereitung:
Die Probe wird in Protein-Ladepuffer (s. Kap. 3.3.2) zu etwa 10 mg/ml Protein aufgenommen
und 4 min bei 95 °C gekocht. Bei Ganzzell-Lysaten vor dem Auftragen 20 min bei 30000 g
zentrifugieren, um DNA-Bestandteile abzusenken. Je nach verwendetem Kamm werden 2-10
µl Probenvolumen aufgetragen und das Gel gestartet. Erreicht die BPB-Lauffront das
Gelende, wird gestoppt.
Programmlauf: 10 min 15 mA, 50 min 20 mA
4.3.2 Erste Dimension, Isoelektrische Fokussierung
In der ersten Dimension trennen sich die Proteine im Proteingemisch entsprechend ihres
isoelektrischen Punktes (IEP) auf. Dazu ist im Gel der hier verwendeten
Fokussierungsstreifen (GE Healthcare) ein linearer, immobilisierter pH-Gradient eingebettet
[Görg, 1993]. Dieser Gradient kann sich über variable pH-Bereiche erstrecken; in
vorliegender Arbeit sind pH-Bereiche von 4-7 oder 3-10 genutzt worden. Legt man an die
Enden der Streifen eine Spannung an, so wandern die auf dem Gel aufgebrachten Proteine
gemäß ihrer Nettoladung in Richtung Anode oder Kathode. Während dieser
Auftrennungsstrecke werden die Proteine von den Ampholyten des pH-Gradienten in der
Matrix in Richtung Anode protoniert, in Richtung der Kathode deprotoniert.
Ist der saure oder basische Wert während des Proteinlaufes im Gel so hoch, dass er die
Nettoladung des Proteins gleich Null setzt, wandert das Protein auch nicht mehr im
Stromfluss; es hat seinen IEP erreicht.
1 C=Acryl-, Bisacrylamid (g/100g); T=Bisacrylamid/Acrylamid (g/g)