Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Diskussion 91
Färbung der Proteine wird die bioinformatische Auswertung der Gele auch immer komplexer,
sensitiver und ausgereifter, aber besonders bei Hochdurchsatz nahezu unverzichtbar [für eine
Übersicht s. Berth et al., 2007]. Insgesamt aber zeigt sich die Gelelektrophorese nach
Jahrzehnten der Anwendung deutlich ausgereifter, anwendungsfreundlicher und dank
verschiedenster Protokolle auch meist in der Problemlösung einfacher zu handhaben als die
neuartige PF-2D. Anzumerken bleibt noch, dass Beckman Coulter den Vertrieb und damit
auch die Weiterentwicklung der PF-2D Anfang 2009 eingestellt hat.
Grundsätzlich sollten alle per vergleichender Proteom-Analyse detektierten Unterschiede
auch immer mittels anderer Techniken auf weitere Hinweise der Expressionsdifferenz hin
untersucht und verifiziert werden, so z. B. über die RT-PCR.
6.2 Analyse der identifizierten und putativen Virulenzfaktoren
6.2.1 Bewertung der Identifizierung durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie
Insgesamt konnten 14 Proteine (s. Tab. V.1 und 2) identifiziert werden, obwohl mehrere
Unterschiede aufgedeckt und auch Proteine isoliert wurden. Dass diese Proteine nicht
identifiziert, bzw. keine Massen am Detektor des Massenspektrometers registriert wurden,
kann mehrere Ursachen haben. Es kann an einer zu geringen Proteinkonzentration gelegen
haben, so dass die vom Trypsin zerlegten Peptide im Hintergrundrauschen der Matrix und
anderer Bestandteile untergegangen sind. Die Protease Trypsin selber kann auch gerade bei
der in-Gel-Verdauung in Verbindung mit schwach konzentriertem Protein zu wenig Peptide
generiert haben, wenn bspw. nach den Aminosäureresten Arginin und Lysin saure
Aminosäuren folgen [Thiede et al., 2000]. Möglicherweise konnte das Protein auch
unvollständig verdaut werden, weil Trypsin schlecht in die Gelstücke diffundiert ist oder die
wenigen Peptide nicht genug aus den Gelstücken in die Lösung extrahiert worden sind. Bei
stark Coomassie Blue-gefärbten Proteinen kann es trotz der Waschvorgänge noch
vorkommen, dass übriggebliebener Farbstoff die Ionisation beim Laserbeschuss gehemmt und
somit den Übergang des Peptides in die Flugröhre verhindert oder gestört hat [Lauber et al.,
2001].
Es kann auch vorkommen, dass trotz vieler detektierter Massen diese in der Summe keinem
Protein zugeordnet werden können – möglicherweise weil hier mehrere Proteine in einem
Spot oder einer Fraktion zusammen vorliegen und nicht mehr auseinandergehalten werden
können. Ein weiterer Grund wäre auch, dass posttranslationale Modifikationen, wie