Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Ergebnisse 76
A
B
Abb. V.17 A: Restriktionsanalyse des pQE-30 Vektors mit integrierter Gesamtsequenz von pilN (links neben
den beiden Markern) und der geschnittenen pilN-Version (rechts neben den Markern). Die roten Pfeile zeigen
die zuvor aus dem Vektor mit den Restriktionsenzymen BamH1/SalI (ca. 580 bp, links) bzw. EcoRI/SalI (ca.
450 bp, rechts) herausgeschnittenen klonierten PCR-Produkte.
B: Testexpression mit E. coli M15-Zellen, induziert mit 0,5 mM IPTG und 3 Std. 25 °C Expression. Die roten
Pfeile indizieren das überexprimierte, lösliche PilN ohne den Membranteil. Links neben dem Marker sind die
Testexpressionen mit dem kompletten PilN. Hier ist im löslichen Überstand kaum eine Zunahme im Vergleich
zum nicht induzierten Kontrollstamm zu sehen.
A
B
C
Abb. V.18 A und B: SDS-Gele von Testexpressionen der pQE-30 PreScission/pGEX-Konstrukte mit E. coli
M15- (A), tuner- (B) und BL21- (B) Zellen. Die roten Pfeile zeigen das überexprimierte PilN (ohne
Membranteil) entweder 6-fach Histidin fusioniert (ca. 18,5 kDa) oder als GST-Tag (ca. 42 kDa) an.
C: Westernblot der gleichen Konstrukte wie in A und B. Markerangaben sind in kDa. In der linken Hälfte ist ein
Anti-Histidin-Antikörper benutzt worden, in der rechten Hälfte ein Antikörper, der gegen GST gerichtet ist.
Neben den eigtl. Proteinbanden sind jeweils noch andere unspezifische Banden zu sehen, die entweder aus dem
Stoffwechsel der benutzten E. coli-Zellen stammen oder abgelöstes GST-Protein darstellen. In der linken Hälfte
zeigen sich unspezifische Banden, die möglicherweise Aggregate oder Zerfallsprodukte darstellen.
Nachdem die Richtigkeit der genetischen Konstrukte festgestellt und die besten
Expressionsbedingungen ausgewählt wurden, wurde die Expression von PilN im großen
Maßstab (meist 6 Liter) gestartet. Dafür sind alle Konstrukte mit der gestutzten pilN-
Gensequenz, die die putative Membranregion am N-terminalen Ende auslässt, genutzt
worden.