Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Zusammenfassung 2
Proteine identifiziert werden, manche davon mit klarem Bezug zur Virulenz (z. B. PilN, FliC,
HtpB, s. Kap.2.2.1).
Als effizienter in der Handhabung und sensitiver/spezifischer im Datenvergleich der
Trennungsbilder wurde abschließend die 2D-Gelelektrophorese bewertet; insbesondere dann,
wenn man die zur Verfügung stehenden neuesten Applikationen zur Nutzung mit heranzieht.
Die markanteste Protein-Entdeckung war das komplette Ausbleiben des als PilN
identifizierten Proteins der flaR - -Mutante in einer PF-2D-Fraktion. PilN stellt eine essentielle
Komponente der Biosynthese des als Virulenzfaktor eingestuften TypIV-Pilus der Oberfläche
von L. pneumophila dar.
Mit der RT-PCR und einem Test zur sog. „twitching motility“ (eine TypIV-Pili vermittelte
Ausbreitungsform) galt es, diesen Proteom-Befund weiter zu analysieren. Die
Untersuchungen zur Expression von pilN in der flaR - -Mutante auf Transkriptom-Ebene
konnten einen Ausfall der mRNA von pilN, wie das Fehlen vom PilN-Protein auf der flaR - -
Mutantenseite vermuten ließ, weder in der stationären noch der exponentiellen
Wachstumsphase bestätigen. Eine direkte, zuvor postulierte Regulation der Pilus-Gene einzig
durch den deletierten LTT-Regulator FlaR konnte mittels der RT-PCR demzufolge nicht
bestätigt werden. Allerdings hat der Nachweis der „twitching motility“ ergeben, dass die
flaR - -Mutante deutlich in ihrer flagellenunabhängigen Motilität durch die TypIV-Pili im
Vergleich zum Wildtyp limitiert ist. Genauso kann das in der Mutante übermäßig vorhandene
HtpB-Protein mit seiner für L. pneumophila beschriebenen Verbindung zur Adhärenz an
eukaryontischen Zellen als Oberflächenprotein (ähnlich einer weiteren Funktion der TypIV-
Pili) als Hinweis gewertet werden, dass diese Überexpression als Kompensation der
eingeschränkten oder fehlenden Pili zu verstehen ist. Damit wurde neben dem „twitching
motility“-Test auch mit diesem Versuch eine womöglich indirekte Regulation von PilN und
eventuell von weiteren Bestandteilen des TypIV-Pilus durch FlaR als plausibel erachtet.
Parallel dazu wurde PilN – auch wegen seiner unbekannten Funktion – rekombinant für die
Überexpression in E. coli hergestellt und mittels verschiedener Fusionsproteinvarianten
affinitätschromatographisch aufgereinigt. Mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie
konnte PilN bezüglich seiner molekularen quartären Organisation weiter charakterisiert
werden.
Über die Dampf-Diffusionskristallisation konnten Kristalle erzeugt und optimiert werden, die
am Synchrotronring Röntgenbeugungsdaten bis zu einer Auflösungsgrenze von 3,2 Å
lieferten und somit zu einer vorläufigen kristallographischen Charakterisierung der PilN-
Kristalle geführt haben.