Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Methoden 41
Der Gradient erstreckt sich dabei folgendermaßen:
Zeit (in min) Gradient (in %) Dauer (in min)
5 5 0,1
5,1 25 0,5
5,6 55 18
23,6 70 3
26,6 100
Erst mit diesem Gradienten ist es zu einem optimalen Trennungsbild der Proteine gekommen.
Meist wurde vor dem präparativen (500 µl Injektionsvolumen) Lauf ein analytischer (50 µl-
100 µl) Lauf aller Fraktionen durchgeführt, um ggf. die Proteinunterschiede zweier
verschiedener Läufe besser eingrenzen zu können. In der präparativen Auftrennung sind die
separierten Proteine von einem Fraktionskollektor aufgefangen worden, um sie später per
MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Analyse identifizieren zu können.
• UV-Lampe der zweiten Dimension kalibrieren, Puffer einstellen, die RP-Säule mit den
Puffern A und B equilibrieren und in den Heizblock (50 °C) einspannen.
• Methodik und Leergradienten starten, ausgewählte Fraktionen der 1. Dimension einfügen
und per Injektor der 2. Dimension zuführen.
• Gesammelte Fraktionen für den tryptischen Verdau vorbereiten und danach bei -70 °C
einfrieren.
4.5 Proteinidentifizierung mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie-
Analyse
Proteine, entweder von der PF-2D oder über 2D-PAGE aufgetrennt, lässt man tryptisch
verdauen; die Protease Trypsin spaltet das Protein nur nach den Aminosäureresten Lysin und
Arginin (ausgenommen, es folgt Prolin), wodurch ein für jedes Protein spezielles
Verdauungsmuster entsteht. Mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie können die einzelnen
Massenspektren der so gespaltenen Peptide aufgenommen werden.
Dieser gewonnene, sog. „peptide mass fingerprint“ (PMF), also die detektierten Massen in
Dalton, können mittels diverser Software per Proteindatenbankvergleich zur Identifizierung
des Proteins genutzt werden.
Das MALDI-System nutzt einen pulsierenden Laserstrahl, der zur Desorption der Peptidprobe
und der sie umgebenden Matrix führt. Das bedeutet, dass die Peptidmoleküle durch die