Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Diskussion 88
Spannungsspitzen von 6000 V zulässt. Neuere Fokussierungsanlagen mit integriertem
Spannungsgeber können durch höhere Spannung die Fokussierungszeit verkürzen und
außerdem nahtlos von der Diffusions- zur Fokussierungsphase in einem Schritt übergehen.
Aber selbst hierbei nimmt die eigtl. Fokussierung noch mindestens 12 Stunden in Anspruch.
Hingegen ist die erste Dimension der PF-2D innerhalb von 5 Stunden komplett
abgeschlossen.
Die Auflösungs- bzw. die Fokussiergrenze ist bei der PF-2D und der
Gelelektrophorese gleichermaßen hoch, wenngleich die pH-Grenze im basischen Bereich bei
der Chromatographie bei maximal pH 9,0 liegt, die isoelektrische Fokussierung der
Gelelektrophorese technisch bis pH 10,0 einsetzbar ist. Einige Versuche zeigen aber, dass mit
entsprechenden Puffern bei der PF-2D durchaus in noch höhere basische Bereiche bis hin zu
Werten von 11,3 vorgestoßen werden kann [Shin et al., 2006]. Das ist beim Fokussieren der
zweidimensionalen Gelelektrophorese auch möglich [Görg et al., 2009], aber basische
Proteine sind meist schwerer in die Streifen zu bringen oder schlecht aufzutrennen
[Pennington et al., 2004]. Allerdings ist mit der flüssigbasierten Säulenchromatographie keine
Auftrennung von stark sauren Proteinen möglich, wenngleich sie aber als Durchfluss
gesammelt werden können. Das gilt auch für die basischen Proteine außerhalb der pH-Grenze.
Dennoch konnten die Proteine hier nicht in der zweiten Dimension aufgetrennt werden, weil
dies stets zur nahezu irreparablen Verstopfung der Reversphasensäule geführt hat. Ursächlich
dafür könnten möglicherweise membranäre Bestandteile, stark hydrophobe Proteine oder
auch aggregierte Proteine sein.
Der Aspekt des Zeitaufwands in der zweiten Dimension spricht hingegen für die
Gelelektrophorese. Auch wenn die Auftrennung, der Gellauf, etwa genauso lange braucht wie
die Auftrennung der meisten Fraktionen in der PF-2D, lassen sich in der Laufkammer bis zu
sechs Gele parallel bearbeiten. Genauso spricht die Handhabung der einzelnen
Expressionsunterschiede für die Elektrophorese. Denn selbst wenn man auf den analytischen
Vorablauf in der PF-2D zur Eingrenzung der Unterschiede verzichtet, lässt sich zwar der
gesamte Ablauf inklusive Fraktionssammlung automatisieren, aber dennoch gilt es, mehrere
Dutzend verschiedene gesammelte Fraktionen pro Auftrennung zu handhaben. Die Handhabe
bei der Gelelektrophorese ist dagegen auf ein Gel pro Organismus reduziert.
Die Vorbereitung der einzelnen Proteine für die MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Analyse
ist insgesamt gleich zu bewerten, der Zeitaufwand ähnlich. Ein direktes Anschließen der PF-
2D an das im Labor später zur Verfügung gestandene Nano-HPLC-ESI-Massenspektrometer
hätte diesen Ablauf sicherlich vereinfacht und beschleunigt.