Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Ergebnisse 74
Proteinname
und Abb.-
Nr.
IEP in der
PF2D/theor.
Beschreibung/Funktion
Molekulargewicht
Sequenzabdeckung
identifizierte
Peptide/Faktor der
Peakflächenerhöhung
Proteine, die im Wildtyp im Vergleich zur flaR - -Mutante erhöht erschienen
PilN; s. Abb.
V.9
Trigger
factor; s.
Abb. V.12
21,2 kDa 5,1-5,4/9,5
52,5 kDa 4,7-5,0/5,1
PilN ist mit unbekannter
Funktion involviert in die
Biosynthese des TypIV-
Pilus
Eine Peptidyl-Prolyl-cistrans-Isomerase,
auch in
den Protein-Export
involviert
31,3 %
46,8 % 22/2,0
6/ in der Mutante nicht
detektierbar
Tab. V.2 Identifizierte Proteine aus der PF-2D-Untersuchung und deren Beschreibung. Der Faktor der
Peakflächenerhöhung bezieht sich immer auf den entsprechenden Peak entweder der Mutante oder des Wildtyps.
Eine Erhöhung um den Faktor 2,0 veranschaulicht, dass die dimensionslos angegebene Fläche dieses Peaks 2-
mal so groß ist wie die des entsprechenden Peaks in der Mutanten- oder Wildtyp-Auftrennung.
5.3 Rekombinante Herstellung des PilN-Proteins
PilN, als der dominanteste aufgedeckte Unterschied in der zweidimensionalen Auftrennung
der Hochdruckchromatographie, ist als Protein an der Biosynthese des TypIV-Pilus beteiligt.
Nach Kochs Postulat [Falkow, 1988] wären die TypIV-Pili der Legionellen durchaus als
Virulenzfaktoren anzusehen, PilN als essentieller Bestandteil (s. Kap.2.3.1) des Pilus damit
ein interessantes Untersuchungsobjekt, zumal keine genaue Funktion in der Literatur
beschrieben ist. Aus diesen Gründen wurde pilN aus dem Legionella-Genom amplifiziert und
für die rekombinante Herstellung in E. coli-Zellen in verschiedene Vektoren umkloniert. Mit
dem daraufhin überexprimierten und aufgereinigten Protein wurden Kristallisationsexperimente
durchgeführt, um dann über die Röntgenkristallographie die dreidimensionale
Struktur des Proteins aufzuklären.
5.3.1 Überprüfung der molekulargenetischen Arbeiten an PilN
Insgesamt sind für PilN mehrere Konstrukte erstellt worden. Die Gesamtsequenz ist im
Vektor pQE-30 (6-fach Histidin-Fusion, N-terminal) eingebracht worden. Wie aber bereits
erwähnt (s. Kap. 2.3.1), ist mit Hilfe des Programms SOSUI eine potentielle Transmembranbzw.
Membrananker-Region vorhergesagt worden (s. Abb. V.16), die die Löslichkeit und die
Kristallisation des Proteins enorm erschweren kann. Das konnte auch mit Löslichkeitstests
bestätigt werden, da das komplette PilN-Protein trotz mehrerer Detergentien nur in sehr