Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Ergebnisse 83
5.5 Real-Time-PCR-Analyse
Um zu überprüfen, ob das entdeckte Fehlen des PilN-Proteins auf Proteom-Ebene in der flaR -
-Mutante ebenso für das mRNA-Produkt von pilN gilt, wurde das Transkriptom der Mutante
mit dem Wildtyp verglichen. Dazu ist die Gesamt-RNA beider Bakterien zum Zeitpunkt der
stationären Wachstumsphase (genau wie beim Isolieren des Gesamtproteins) isoliert worden.
Die dabei auch vorliegende gesamte mRNA des Organismus wurde mit Hilfe von Reverser
Transkriptase und speziellen Primern in cDNA umgeschrieben, wobei die mRNA beim
komplementären Synthesevorgang verdaut wurde, die cDNA also ein genaues Mengenabbild
der mRNA darstellt. Die cDNA wurde daraufhin als DNA-Matrize in der sich anschließenden
PCR eingesetzt. Amplifiziert durch entsprechende Beigabe von Primern wurden nur die Gene
pilN und gyrA. GyrA ist hierbei ein sog. Haushaltsgen, welches zu jedem Zeitpunkt der
Wachstumsphase bei Legionella gleich stark vorliegen sollte und somit zur Abschätzung der
Expressionsstärke von pilN herangezogen werden kann. Zugegen ist noch ein
Fluoreszenzfarbstoff, der proportional mit der Menge des Amplifikates zunimmt und daher
die Bestimmung des CT-Wertes („threshold cycle“), also des Zyklus, ab dem sich die
emittierte Wellenlänge des Fluoreszenzfarbstoffes erstmalig signifikant vom
Hintergrundrauschen abhebt, zulässt. Obwohl eine tatsächliche quantitative Analyse der
mRNA zum Zeitpunkt der Entnahme möglich wäre, interessiert hier nur der Vergleich, also
die relative Analyse zwischen Wildtyp- und flaR - -Menge an pilN-cDNA.
5.5.1 PilN-Genexpression vom Wildtyp Legionella pneumophila und der flaR - -Mutante
Um eine Kontamination mit genomischer DNA (gDNA) ausschließen zu können, ist von
jedem RNA-Isolat, welches zum Umschreiben in cDNA genutzt wurde, eine PCR mit
anschließender Geltrennung getätigt worden. Ist es dabei zur Amplifikatbildung gekommen,
ist die Probe nachträglich mit DNase I behandelt und erneut überprüft worden, oder sie wurde
direkt verworfen (Daten nicht gezeigt).
Wie bereits erwähnt, ist das Transkriptom beider Stämme gegen Ende der stationären Phase
isoliert worden, weil anzunehmen ist, dass es vor allem während dieser transmissiven Phase
zur Expression des pilN-Gens als Bestandteil des Pilus und somit eines Virulenzfaktors
kommen würde. Zum Vergleich dazu ist die Gesamt-RNA von Legionellen auch in der
exponentiellen Wachstumsphase isoliert worden. Überraschenderweise zeigte sich dabei kein
signifikanter Unterschied in der Expressionsstärke des pilN-Gens, auch nicht im Verhältnis
zum gyrA-Gen. Darüber hinaus konnten nicht jedes Mal die gleichen CT-Werte erreicht