Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Methoden 36
Spannung. Unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten aufgrund der unterschiedlichen
Molekülgrößen der Proteine und deren Wechselwirkung mit dem Acrylamidgel führen zu
dem erzielten Trennungsbild.
N,N´-Methylbisacrylamid lässt zusammen mit Acrylamid, initiiert durch den Radikalstarter
APS und den Radikalstabilisator TEMED, ein dreidimensionales Netzwerk entstehen, dessen
Porengröße abhängig vom Verhältnis zwischen Acrylamid und N,N´-Methylbisacrylamid ist.
Dabei verringert sich die Porengröße mit zunehmendem N,N´-Methylbisacrylamid-Anteil.
Durch die unterschiedliche Porengröße kann die elektrophoretische Mobilität der Proteine
verändert werden. Beispielsweise lassen sich kleine Proteinmoleküle besser im Gel
auftrennen, wenn die Konzentration beider Acrylamid-Moleküle im Gesamtvolumen höher ist
(> 12 %) und das Verhältnis zwischen Acrylamid:N,N´-Methylbisacrylamid bei etwa 19:1
oder kleiner ist.
Durch die Behandlung der Proteine mit SDS werden die Proteine denaturiert, d.h. sie
verlieren ihre Quartär-, Tertiär- und Sekundärstruktur. Außerdem binden die meisten Proteine
SDS in einem konstanten Masse:Ladungsverhältnis – ca. 1,4 g SDS pro g Protein –, so dass
alle Proteine entsprechend ihrer Masse gleich stark negativ geladen sind [Birdi & Steinhardt,
1978; Weber & Osborn, 1969].
Der DTT- oder β-Mercaptoethanol-Zusatz öffnet bzw. reduziert die Disulfid-Bindungen, die
innerhalb eines Proteins auftreten können. Iodacetamid, welches oft während der
isoelektrischen Fokussierung der Proteine hinzugegeben wird, acetyliert die
Sulfhydrylgruppen, so dass es zu keiner erneuten Disulfidbindung kommen kann. Damit
sollten alle Proteine nur noch in ihrer Primärstruktur vorliegen und keine unterschiedlichen
Konformationen den Trennlauf beeinflussen können. Die Elektrophorese der Proteine wird
dadurch nur größenabhängig.
Um scharf erscheinende Proteinbanden zu erhalten, teilt man das Polyacrylamidgel in 2 Teile:
dem grobporigen, pH-niedrigen Sammelgel und dem feinmaschigen Trenngel. Die
Bandenschärfung wird mit der Anwesenheit von Folge- und Leitionen begründet [Gallagher,
2007; Michov, 1989].
Alle in der vorliegenden Arbeit benutzten SDS-PAGE sind nach Laemmli [1970]
durchgeführt worden.