Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Material 29
• Legionella-Supplement Medium: 2,5 g ACES, 250 mg α-Ketoglutarat, 100 mg L-Cystein,
60 mg Eisenpyrophosphat, pH 6,9; bei 40 °C langsam rühren, schrittweise mit 5 M KOH
den pH-Wert einstellen und auf 50 ml Endvolumen mit ddH 2 O auffüllen; sterilisieren
durch 0,2 µm Filtration.
Auf 450 ml Vollmedium kommen 50 ml Supplement Medium.
• Hefe-Agarplatten: 12 g CYE (Charcoal yeast extract) Agar vom Hersteller Oxoid in 450
ml ddH 2 O lösen und autoklavieren. Dann auf ca. 60 °C abkühlen und mit 50 ml
Supplement Medium versetzen und auf Petriplatten verteilen.
• Antibiotika-Zusätze: (nur bei Kanamycin-Resistenzen der Mutanten flaR - , fliA - , und flaA - )
Kanamycin: 5 µg/ml in Flüssigkultur; 12,5 µg/ml auf Agarplatten.
3.2.2 Medien und Antibiotika für Escherichia coli-Stämme
• LB (Luria Bertani) Medium: 10 g Bacto ® Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, pH 7,0 mit
NaOH einstellen, in 1000 ml mit ddH 2 O lösen.
• Doppel-TY (Trypton, Yeast) Medium: 20 g Bacto ® Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl,
gelöst in 1000 ml doppelt destilliertem Wasser.
• SOC Medium: 2 g Bacto ® Trypton, 0,5 g Bacto ® Hefeextrakt, 1 ml 1 M NaCl, 0,25 ml
1 M KCl, 1 ml 2 M Mg 2+ , filtersterilisiert, 1 ml 2 M Glucose, filtersterilisiert. In 100 ml
ddH 2 O lösen.
• Agarplatten: auf 1000 ml LB oder TY Medium 15 g Agar geben und nach Abkühlen auf
ca. 60 °C Platten gießen.
• X-Gal-Platten: wie LB-Agarplatten, nur zusätzlich mit Ampicilin, 0,5 mM IPTG und 80
µg/ml X-Gal.
• Antibiotika-Zusätze: Ampicillin: 100 µg/ml; Carbenicillin: 50 µg/ml; Chloramphenicol:
34 µg/ml; Kanamycin: 50 µg/ml.
3.3 Lösungen und Puffer
3.3.1 Lösungen für den Zellaufschluss
• Zellwaschpuffer: 50 mM Tris, gelöst in ddH 2 O, pH 7,0.