Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Diskussion 90
nie zu 100 % deckungsgleich, wodurch es immer schwierig ist, die Proteine untereinander
komplett zuzuordnen.
Wegen dieser Gel-Variabilität leidet auch die Reproduzierbarkeit der Gelelektrophorese, ein
weiteres Kriterium in dieser Übersicht. Allerdings zeigt sich auch der Fokussierungsschritt
innerhalb der Elektrophorese nicht unanfällig. Oftmals konnte während der Diffusionsphase
nur wenig Protein in die immobilisierten Acrylamidgelstreifen gebracht werden, so dass
wenig bis gar kein Protein auf den anschließenden Gelen zu beobachten war.
Anders präsentiert sich die erste Dimension der Säulenchromatographie; das Elutionsprofil
zeigte sich stets gut reproduzierbar und konstant (s. Abb. V.8), Abweichungen bezüglich der
nach pH gesammelten Fraktionen waren gering und lagen innerhalb der zu erwartenden
Spanne. Die zweite Dimension hingegen war ebenfalls schlecht reproduzierbar. Mehrfach hat
die Auftrennung in der reversen Phase stark abgenommen (s. auch Abb. V.14), einzelne
Proteine/Peaks sind zu einem großen Peak zusammengewachsen. Proteinfraktionen der ersten
Dimension sollten außerdem so schnell wie möglich in der zweiten weiterbearbeitet werden,
weil auch hier die Reproduzierbarkeit selbst bei -70 °C eingefrorenen Proben stark nachließ.
Die fokussierten Acrylamidstreifen der Gelelektrophorese hingegen konnten gut weggefroren
und später genutzt werden, wenngleich auch hier die sofortige Weiterbearbeitung vorzuziehen
ist.
Zuletzt soll ein Blick auf den Kostenfaktor geworfen werden. Neben den Anschaffungskosten
der Pumpeneinheiten der PF-2D tragen vor allem die Ionenaustauschersäule und die
Reversphasensäule, denen beiden vom Hersteller nur eine Laufgarantie von fünf
Auftrennungsläufen bescheinigt wird, zum Anstieg der Wartungskosten bei. Mit verbesserten
Reinigungsmethoden [Barre & Solioz, 2006] konnte zumindest die Laufzeit der
Fokussierungssäule erhöht werden. Insgesamt zeigt sich aber auch unter Berücksichtigung
anderer Verbrauchsmaterialien die zweidimensionale Gelelektrophorese deutlich
kostengünstiger als die zweidimensionale Proteinfraktionierung an der
Chromatographieanlage.
Als Fazit bleibt, dass sich zur Virulenzfaktorsuche oder einfach zur Proteomdifferenz-
Aufklärung zwischen Wildtyp und Mutante oder behandelten und unbehandelten Zellen die
zweidimensionale Gelelektrophorese besser eignet. Vor allem dann, wenn man auf die
neuartigen Fluoreszenzfarbstoffe der DIGE ausweicht und man so vor allem die geringe
Sensitivität bei Coomassie Blue als auch die Vergleichbarkeit mehrerer Proteome nochmals
erhöhen kann. Allerdings wird die Proteinidentifizierung, also das Ausschneiden der
jeweiligen Proteinspots, nicht unkompliziert zu gestalten sein. Neben der Anfertigung und