Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Methoden 42
Laserenergie vom festen in den gasförmigen Zustand übergehen. Die Matrix protoniert dabei
die Peptide, die, meist einfach positiv geladen, in die feldfreie Vakuum-Flugröhre eintreten.
Die Matrix unterstützt die Probe also in ihrer Desorption und Ionisation. Das Verhältnis von
Analyt zu Matrix sollte etwa bei 1: 10 3 -10 5 liegen.
Innerhalb der Flugröhre werden die Ionen durch deren Masse-/Ladungsverhältnis getrennt;
die schweren Ionen haben eine langsamere Beschleunigung als die leichten. Die leichten
Peptide erreichen den Detektor somit eher als die schweren. Dort werden die Peptide
nacheinander registriert und deren Massen anhand der Flugzeit berechnet und dargestellt.
Massen, die größer als 4000 Da sind, können durch die gewählten Einstellungen und die
geringer werdende Auflösung nicht mehr isotopen- und daltongenau aufgelöst werden.
4.5.1 Tryptischer Verdau
Proteinspots aus SDS-Gelen werden ausgestochen und dann folgendem Protokoll unterzogen:
• Das Gelstück mitsamt dem Protein in einer Mikrotiterplatte oder einem Eppendorfgefäß
5 min in 150 µl Waschlösung A (s. Kap. 3.3.4) bei RT waschen.
• Lösung A verwerfen und durch 150 µl Waschlösung B ersetzen; 30 min schwenken.
• Lösung B durch 150 µl Waschlösung C ersetzen und ebenfalls 30 min lang schütteln.
• Waschlösung C abziehen und Gelstücke bei 37 °C ca. 10 min lang trocknen.
• 10 µl Trypsinlösung und 10 µl Waschlösung D addieren; 1 Std. bei 4-8 °C diffundieren
lassen.
• Mit weiteren 10 µl Waschlösung D versetzen.
• Ca. 24 Stunden bei 37 °C inkubieren lassen, danach ggf. im Ultraschallbad behandeln, um
die Peptide aus dem Gelstück „herauszudrücken“.
Für gesammelte Fraktionen aus der PF-2D ergibt sich eine andere Herangehensweise:
• Probe über die Vakuumzentrifuge eindampfen.
• 15 µl 6 M Harnstoff/333 mM Tris hinzugeben.
• 4 µl 10 mM DTT hinzugeben und für etwa 1 Std. bei 45 °C inkubieren.
• 41 µl 50 mM Ammoniumbicarbonat und die entsprechende Trypsinmenge 3 aus einer
125 µg/ml Konzentration dazugeben.
3 Die Trypsinmenge berechnet sich aus der Peakfläche des entsprechend zu verdauenden Proteins. Mittels der
32 Karat Software (Beckman Coulter) lassen sich Peakflächen errechnen und angeben: liegt dieser vom
Programm dimensionslos angegebene Flächenwert unterhalb von 0,7, gibt man 1,5 µl der Trypsinlösung dazu.
Steigt der Wert auf über 7,0, erhöht man die Menge auf 5-10 µl Trypsinlösung.