Métabolisme et fonctions des acides gras oméga-3 à longue chaîne ...

Matériels & Méthodes
I-5 Incubation des adipocytes 3T3-L1 avec les AGPI n-3
Les adipocytes 3T3-L1 sont incubés pendant 2h, 4h ou 24h avec différentes
concentrations de DHA (Sigma #D2534) ou d’EPA (Sigma #E2011) (1, 10 et 100µM) amené
par 50µM d’albumine sérique bovine (Sigma #A7030). Les complexes albumine-DHA et
albumine-EPA sont préalablement préparés à 37°C pendant 4h.
4h avant l’incubation des acides gras, le milieu de culture a été enlevé et remplacé par un
milieu sans sérum. Les cellules sont ensuite rincées avec du D-PBS puis incubées avec les
solutions d’albumine-DHA ou d’albumine-EPA. A la fin des incubations, les milieux sont
prélevés et conservés à -80°C en attendant d’effectuer les différents dosages. Les cellules,
après rinçage avec du D-PBS, sont récupérées par grattage.
I-6 Incubation des adipocytes 3T3-L1 avec les dérivés oxygénés
des AGPI n-3
Les adipocytes 3T3-L1 sont préalablement incubés dans un milieu sans sérum pendant
4h puis sont incubés avec différents dérivés oxygénés des AGPI n-3 apportés dans 0,4%
d’éthanol dans du milieu sans sérum pendant 2h et 4h.
A la fin des incubations, les milieux sont prélevés et les cellules, après rinçage, sont
récupérées par grattage.
II- Dosages protéiques
II-1 Dosage des protéines du milieu de culture par la méthode de
Bradford (1976)
Le kit « BioRad’s protein assay » est utilisé pour réaliser ce dosage. Ce dernier est
basé sur le changement de coloration du bleu de Coomassie après liaison avec les acides
aminés aromatiques (tryptophane, tyrosine et phénylalanine) et les résidus hydrophobes des
acides aminés présents dans les protéines.
Le volume de milieu à doser est prélevé et ajusté à 10µL avec de l’eau ultrapure. On ajoute
200µL de solution « BioRad’s protein assay » (BioRad #500-0006) diluée 4 fois. Après
70