Métabolisme et fonctions des acides gras oméga-3 à longue chaîne ...

Matériels & Méthodes
agitation, la densité optique est lue à 595nm en microplaque 96 puits à l'aide d'un lecteur
spectrophotométrique de plaques multipuits (PowerWave X, BIOTEK INTRUMENTS). La
concentration est déterminée grâce à une gamme étalon d’albumine sérique bovine (Sigma
#A6003) (0-10 µg de protéines) réalisée dans les mêmes conditions.
II-2 Dosage des protéines cellulaires par la méthode de Lowry
(1951)
Cette méthode combine une réaction au biuret (formation d'un complexe pourpre entre
le biuret (NH 2 -CO-NH-CO-NH 2 ) et deux liens peptidiques consécutifs en présence de cuivre
en milieu alcalin) et une réaction au réactif de Folin-Ciocalteu. Ce dernier, à base de
phosphomolybdate et de phosphotungstate, réagit avec les tyrosines et les tryptophanes pour
donner une coloration bleue.
L’échantillon est hydrolysé au préalable pendant 15min dans une solution de NaOH 1N.
10µL d’échantillon sont prélevés et ajoutés à 1mL de mélange réactionnel contenant du
Na 2 CO 3 , du NaOH 5N, du tartrate de Na 2% et du sulfate du cuivre 1%. Après 10min, le
réactif de Folin (Merck #3934529) dilué au ½ est ajouté.
Après 30min, la densité optique est lue à 700nm à l'aide d'un lecteur spectrophotométrique de
plaques multipuits. La concentration est déterminée par comparaison à une gamme étalon
d’albumine sérique bovine réalisée dans les mêmes conditions.
III- Dosage des adipokines
Le surnageant dans lequel les adipocytes ont été incubés est utilisé pour doser
l’adiponectine sécrétée et libérée pendant les différentes périodes d’incubation.
L’adiponectine est dosée à l’aide d’un kit EIA (SPIBIO #A05187) selon les recommandations
du fabricant. Il en est de même pour le dosage de la leptine (SPIBIO #A05176).
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