Métabolisme et fonctions des acides gras oméga-3 à longue chaîne ...

Matériels & Méthodes
IV- Mesure de l’expression génique par PCR quantitative
en temps réel
IV-1 Extraction des ARN
Les ARN totaux des cellules sont extraits à l’aide du kit QIAGEN RNeasy mini kit
(QIAGEN #74106) selon le protocole fourni par le fabriquant.
Les cellules sont au préalable rincées avec du D-PBS puis grattées dans du tampon de lyse
(Tampon RLT, fournis dans le kit) et 1% de β-mercaptoéthanol (Sigma #M7154). Suite à une
homogénéisation à la pipette, les échantillons sont laissés 10min à 30°C puis centrifugés 3min
à 10 000t/min à température ambiante. La phase intermédiaire est récupérée et mise dans un
tube propre puis un passage sur seringue est effectué afin de casser les ADN. De l’éthanol
70% « Rnase free » est ajouté à la phase intermédiaire. Le mélange est ensuite déposé au
milieu d’une colonne d’affinité (gel de silice) sous laquelle est placé un tube de collection.
Suite à une centrifugation d’1min à 10 000t/min pendant laquelle l’ARN se fixe à la colonne,
deux lavages avec différents tampons fournis dans le kit sont effectués. L’élution des ARN se
fait avec de l’eau « Rnase free » que l’on dépose sur la colonne suivie de plusieurs
centrifugations. Les ARN récoltés sont utilisés immédiatement pour leur quantification ou
placés au congélateur à -80°C.
IV-2 Transcription inverse (RT)
Avant d’effectuer la transcription inverse des ARN obtenus, il est nécessaire de
mesurer, à l’aide d’un Nanodrop NANO 001, leur densité optique et d’évaluer d’éventuelles
contaminations. La mesure se fait avec 2µL d’échantillon et elle permet ainsi d’utiliser la
même quantité d’ARN à transcrire en ADNc.
La RT se fait avec 250ng d’ARN dilués dans de l’eau qui sont préalablement dénaturés à
65°C pendant 5min. 8,5µL de mélange réactionnel de RT sont ajoutés à la solution d’ARN.
Le mélange réactionnel contient : 4µL de tampon (First Strand Buffer, 5X, Invitrogen
#18064-022) ; 2µL de DTT (0,1M, Invitrogen #18064-022) ; 1µL de dNTP (10mM,
Invitrogen ; mélange de dATP 10mM #18252-015, dCTP 10mM #18253-013, dGTP 10mM
#18254-011 et dTTP 10mM #18255-018) ; 0,5µL d’Oligo dT (0,5µg/µL, Promega #C1101) ;
72