Métabolisme et fonctions des acides gras oméga-3 à longue chaîne ...

Matériels & Méthodes
VI-2 Sacrifices et prélèvement des tissus
Les souris sont sacrifiées à J0 (premier jour de régime) puis à J4, J8, J16 et J32.
Certaines souris ont été nourries pendant 16 jours avec l’alimentation enrichie en DHA puis
les 16 jours suivants avec l’alimentation standard (période de « wash-out »). Le jour du
sacrifice, les souris contrôles et les souris DHA sont choisies aléatoirement. Elles sont
anesthésiées par une injection intrapéritonéale de pentobarbital (30mg/kg) puis elles sont
pesées. Le sang est prélevé par ponction intracardiaque avant d’être centrifugé 5min à
10 000t/min à 4°C. Le plasma est récupéré puis aliquoté avant d’être mis dans de l’azote
liquide puis stocké à -80°C. Les différents organes et tissus sont prélevés puis pesés avant
d’être mis dans de l’azote liquide puis à -80°C jusqu’à l’analyse.
VI-3 Analyse de la composition en acides gras des phospholipides
des tissus par chromatographie en phase gazeuse (GC)
Pour l’analyse de la composition en acides gras, une étape d’extraction puis de
séparation des différentes classes de phospholipides tissulaires par chromatographie sur
couche mince (CCM) sont nécessaires.
Dans l’échantillon, ont été rajoutés au préalable des standards internes, le
diheptadécanoyl-glycérophosphoéthanolamine et le diheptadécanoyl-glycérophosphocholine.
L’extraction des lipides totaux est réalisée par un mélange chloroforme/éthanol (2:1 ; v/v).
Deux centrifugations successives (2000t/min, 10min) permettent de récupérer les lipides
totaux dans la phase organique inférieure. Les phases organiques sont évaporées puis reprises
avec un mélange chloroforme/éthanol (2:1; v/v) avant d’être déposées sur la plaque de gel de
silice (silica gel G60 ; 200×200×0,25 mm ; Merck #1.05721.0001).
La plaque est tout d’abord placée dans une cuve saturée en isopropyléther permettant la
migration des lipides neutres.
Les différentes classes de phospholipides sont séparées avec le système
chloroforme/méthanol/méthylamine à 40% dans l’eau (61:19:5 ; v/v/v) (Fig. 15). La plaque
est révélée par une solution de dichlorofluorescéine et la détection est réalisée sous UV.
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