Métabolisme et fonctions des acides gras oméga-3 à longue chaîne ...

Matériels & Méthodes
V- Analyse des prostaglandines
V-1 Formation de 15-désoxy-Δ 12,14 -PGJ 3 (15dPGJ 3 )
La formation de 15dPGJ 3 se fait à partir de PGD 3 (Cayman #12990) qui est incubée
dans du D-PBS à pH7,4 pendant 72h à 37°C sous agitation douce. Après l’incubation, la
solution est acidifiée à pH3 avec de l’HCl 1N puis de l’acétate d’éthyle est ajouté. Le tube est
homogénéisé puis centrifugé 10min à 1700t/min (GR 4.11, Jouan). Deux extractions
supplémentaires sont réalisées. Les phases organiques sont réunies puis évaporées avant
d’être reprises avec de l’éthanol pour être injectées en chromatographie liquide à haute
performance (HPLC).
V-2 Dosage des prostaglandines par HPLC et détection UV
Les prostaglandines sont séparées par HPLC (Agilent Series 1100). La séparation est
réalisée sur une colonne de silice greffée C18 (Waters Xbridge, 4,6×250mm, 3,5µm) chauffée
à 50°C dans un four thermostaté. L’élution utilise un gradient constitué de deux solvants A et
B avec un débit de 1mL/min. L’éluant A est un mélange acétonitrile/eau (2:8 ; v/v) acidifié à
pH3 par de l’acide phosphorique. L’éluant B est de l’acétonitrile. L’éluant A est pompé seul
pendant 5min, puis il est remplacé progressivement par l’éluant B pour atteindre 100% à
30min jusqu’à 40min. L’élution se poursuit avec l’éluant A seul pendant 5min puis la colonne
est rééquilibrée avec le solvant A. Les prostaglandines sont détectées avec un détecteur à
barrette de diodes à λ = 195nm pour la PGD 2 (Cayman #12010), la PGD 3 , la PGJ 2 (Cayman
#18500) et la PGJ 3 ; λ = 300nm pour la 15dPGD 2 (Cayman #12700) et la 15dPGD 3 , et λ =
305nm pour la 15dPGJ 2 (Cayman #18570) et la 15dPGJ 3 (longueurs d’onde correspondantes
au λ max des molécules). La quantification des molécules est effectuée grâce à une gamme
étalon.
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