Métabolisme et fonctions des acides gras oméga-3 à longue chaîne ...

Matériels & Méthodes
0,5µL de Random hexamers (0,5µg/µL, Promega #C1181) et 0,5µL d’enzyme Superscript II
(Reverse Transcriptase, 200U/µL, Invitrogen #18064-022).
Le programme de RT est le suivant : 10min à 25°C, 60min à 42°C et 15min à 70°C. Les
produits de RT sont ensuite dilués au 1/10 e avec de l’eau « RNase free » puis traités à la
Rnase H (5U, NEB #M0297S), à raison de 1µL dans 20µL de produit RT 1/10 e pendant
20min à 37°C, ceci afin de supprimer les ARN résiduels.
IV-3 PCR quantitative en temps réel (qPCR)
Les ADNc des gènes codants pour l’adiponectine, la leptine et TBP (TATA-Binding
Protein ; gène de ménage) ont ensuite été quantifiés par PCR quantitative en temps réel
(qPCR). Dans un rotorgene 6000 (Corbett Research), la réaction de qPCR a été réalisée à
partir de 5µL de produit de RT dilué au 1/60 e , 4µl d’eau, 0,5µL d’amorce sens (15µM), 0,5µL
d’amorce anti-sens (15µM) et 10µL d’Absolute qPCR Mix (Abgene #AB-1162/B) contenant
entre autres, les dNTP, la Taq polymérase et le SYBR Green. A l’issue des 40 cycles de
qPCR, une courbe de fusion, permettant de vérifier la pureté de l’amplification, est générée.
Pour chaque gène amplifié, une gamme étalon est également réalisée. Grâce à cette dernière,
la concentration d’ADNc peut être déterminée très précisément pour chaque gène.
L’expression des gènes est ensuite normalisée par rapport à l’expression du gène de ménage,
TBP.
Les amorces utilisées pour l’amplification de l’adiponectine, de la leptine et de TBP
sont les suivantes:
Gène Brin Amorces Taille
Adiponectine Sens 5’-AGG-CCG-TGA-TGG-CAG-AGA-TG-3’
Anti-sens 5’-CTT-CTC-CAG-GTT-CTC-CTT-TCC-TGC-3’
161 pb
Leptine Sens 5’-CAC-CAG-GAT-CAA-TGA-CAT-TTC-3’
Anti-sens 5’-TGC-CAG-TGT-CTG-GTC-CAT-CTT-G-3’
124 pb
TBP Sens 5’-TGG-TGT-GCA-CAG-GAG-CCA-AG-3’
Anti-sens 5’-TTC-ACA-TCA-CAG-CTC-CCC-AC-3’
139 pb
Tableau 1: Amorces pour qPCR
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