guida tecnica su metodi di analisi per il suolo ei siti contaminati apat

possono essere ottenute sommergendo le vecchie piastre con circa 10 mL di
M9Y media e poi trasferendo 2-4 mL di questa mistura tampone più nematodi
ad una nuova piastra acqua-agar.
Procedimento
Per i saggi in fase solida viene usato M9Y media in rapporto 1:1 con il
campione da esaminare.
Per preparare il campione da esaminare, 10 g di suolo vengono miscelati
accuratamente con 10 mL di M9Y media per 3 minuti a temperatura ambiente.
Questa miscela viene centrifugata a 10.000 rpm per 20 minuti. Questa
soluzione campione/M9Y è utilizzata per le prove di tossicità/genotossicità.
I saggi di tossicità sono eseguiti con nematodi J2. Innanzitutto è molto
importante che prima di eseguire il saggio si ottenga un adeguato numero di
nematodi J2 di età simile.
Il giorno prima del saggio si prepara una piastra con la prole. I nematodi adulti
(femmine gravide) sono trasferite dalla coltura stock alla piastra con acqua-agar
fresco. Le femmine gravide sono organismi larghi, grassi, con la parte centrale
del corpo scura e granulare a causa delle uova, embrioni e animali J1 al loro
interno.
Esistono tre metodi per trasferire le femmine gravide:
1. Le piastre stock acqua-agar possono essere sommerse con tampone M9
e singole femmine prelevate con micropipette e trasferite in una nuova
capsula acqua-agar sommersa con tampone M9;
2. le femmine possono essere prelevate dalla superficie asciutta dell’agar e
trasferite, utilizzando un ago manicato affilato;
3. viene utilizzato il tampone M9, posto sulla parte inferiore del coperchio
della piastra coltura massa, per lavare le femmine su di un filtro di 12
micron. Le femmine dalla superficie del filtro sono poi sciacquate in
nuova piastra acqua-agar sommersa con circa 5-10 mL di tampone M9.
In tutti i casi, dopo 12 ore (una notte circa) i nematodi adulti nel tampone M9
producono individui J2 su di una nuova piastra acqua-agar.
Ogni femmina produce 10-20 piccoli in 12 ore. Senza cibo i piccoli J2 non
crescono.
Per selezionare i piccoli J2 che vengono utilizzati per il saggio, è opportuno
rifiltrare la miscela vecchia di 12 ore di tampone M9 contenente i nematodi
adulti e i J2 mediante un filtro da 12 micron. Questo filtro separerà gli adulti dai
nuovi nematodi J2. Gli adulti potranno essere conservati e usati per l’avvio di
una nuova coltura.
I piccoli J2 filtrati dalla piastra prole sono versati in una piastra Petri vuota per
facilitare la manipolazione e l’osservazione al microscopio.
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