guida tecnica su metodi di analisi per il suolo ei siti contaminati apat

3.3.4 Saggio di tossicità con Pseudokirchneriella subcapitata
(Selenastrum capricornutum)
Principio del metodo
Il saggio algale permette di evidenziare l’effetto tossico cronico mediante
l’inibizione di crescita della specie algale rispetto ad un controllo (UNI EN,
1993). Il metodo utilizza Selenastrum capricornutum Printz, recentemente
rinominata Pseudokirchneriella subcapitata, un’alga verde monocellulare
(Chlorophyceae) appartenente all’ordine Chlorococcales. Le cellule hanno un
volume cellulare di 40-60 µm 3 , dimensioni di 6-7 µm, e risultano immobili per
l’intero ciclo vitale.
Il sistema di mantenimento in coltura del clone algale e la preparazione dei
terreni sono riportati in appendice.
Preparazione dell’inoculo algale
Il saggio algale prevede l’inoculo nei campioni da esaminare di una quantità
standardizzata di sospensione algale a concentrazione nota e costante; è
importante che ad ogni beuta che fa parte del piano di lavoro venga aggiunta la
stessa quantità di alghe.
L’inoculo viene preparato a partire dalla coltura di mantenimento dove le alghe
si trovano in fase esponenziale di crescita; a tal fine un’aliquota di sospensione
algale di circa una settimana di età viene prelevata, lavata con soluzione di
NaHCO3 (per evitare di trascinare nelle beute del saggio quantità anche minime
di terreno) e mantenuta 24 ore in incubazione nel liquido di lavaggio per
permettere alle alghe di consumare le riserve di nutrienti intracellulari.
Successivamente la sospensione viene sottoposta a conteggio cellulare e
diluita opportunamente per raggiungere la densità necessaria per l’inoculo.
Soluzione per il lavaggio delle alghe
Preparare una soluzione di NaHCO3 15 mg/L in acqua ultrapura, filtrare in
condizioni asettiche su membrana da 0,45 µm e disporre in contenitore sterile.
Tale soluzione può essere mantenuta per un tempo massimo di un mese a 4-
6°C. In tal caso, la soluzione proveniente dal frigorifero, prima di essere
utilizzata, deve essere riportata ad una temperatura di circa 20°C.
Lavaggio della sospensione algale
Prelevare in condizioni asettiche circa 10 mL della coltura algale in fase di
crescita esponenziale, disporre in provetta da centrifuga sterile e tappata,
centrifugare a 1500-2000 rpm (300-600 g) per 5 minuti. Aspirare il sovranatante
con pipetta Pasteur sterile e risospendere le cellule algali nella soluzione di
NaHCO3. Ripetere il lavaggio, risospendere di nuovo nella soluzione di
bicarbonato e disporre per 24 ore nelle stesse condizioni ambientali della
coltura di mantenimento.
40