guida tecnica su metodi di analisi per il suolo ei siti contaminati apat

3.5.3 Mutatox
Il saggio Mutatox (Axzur Anviromental Manual Microtox “Mutatox Genotoxicity
Organic Solvent Solution of Sample”, 1995) utilizza come microrganismo
indicatore un mutante naturale “oscuro” del batterio luminescente (Vibrio
fischeri, ceppo M169) che rileva la presenza di agenti genotossici che
provocano una reversione del ceppo mutato. Questi organismi oscuri, messi a
contatto con materiale genotossico, producono emissione di luce dopo un
periodo di esposizione che va da 16 a 24 ore e i dati di sensibilità sono positivi
se comparati con il saggio di Ames (Jarvis 1995).
Preparazione campione
I campioni in esame, dopo setacciatura a 2 mm, vengono sottoposti ad
estrazione con una miscela acetone/esano 1:1 in Soxhlet.
Gli estratti sono quindi portati a secco e ridisciolti in DMSO, in modo da ottenere
una concentrazione dei campioni in esame pari a 6 g (campione secco)/mL.
Il saggio preliminare viene eseguito quando sono ignoti gli effetti genotossici dei
campioni. In questo saggio il campione viene saggiato alla massima
concentrazione (100%), reidratando direttamente il mezzo colturale con il
campione (mutatox sample medium). Si testano 4-5 diluizioni successive e si
sceglie l’intervallo di concentrazioni entro cui il campione risponde. Per
campioni tossici, si utilizzano dosi 1:10 a partire dall'ultima in cui si evidenzia un
effetto tossico. Nel saggio definitivo, dopo avere individuato l’intervallo di
concentrazione, si testano diluizioni più ravvicinate (es. 1:2). Ogni
concentrazione va effettuata almeno in doppio.
Come controllo negativo, si utilizza il solvente di diluizione dei campioni
(DMSO) in concentrazione inferiore al 2%, oppure la soluzione di S9.
Come controllo positivo si utilizzano il fenolo per campioni con tossici ad azione
diretta e il benzo-a-pirene o i 2-ammino-antracene per campioni con tossici ad
azione indiretta[CJ16].
Espressione dei risultati
Il saggio Mutatox si considera positivo se almeno due dosi rispondono con livelli
di luminosità almeno di due volte superiore al controllo. In alcuni casi la risposta
può essere dubbia, per esempio nel caso in cui il campione risponda per una
sola dose, e quindi va ripetuta la prova.
I risultati del saggio sono espressi in unità di bioluminescenza in dipendenza
della concentrazione saggiata. Il software di acquisizione dei dati permette la
compilazione di tabelle per i diversi tipi di analisi.
Normalmente le unità di bioluminescenza del controllo sono comprese tra 0 e 5
per il mezzo colturale senza S9 e tra 10 e 20 per quello con S9.
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