guida tecnica su metodi di analisi per il suolo ei siti contaminati apat

Tampone fosfato 0.1 M pH 7.7
ONPG 4 mg/L in tampone fosfato (β galattosidasi)
PNPP 4 mg/L in P buffer (fosfatasi alcalina)
Procedimento
Preparazione campione
I campioni in esame dopo setacciatura a 2 mm sono sottoposti a estrazione con
una miscela acetone/esano 1:1 in Soxhlet.
Gli estratti sono quindi portati a secco e ridisciolti in DMSO in modo da ottenere
una concentrazione dei campioni in esame pari a: 6 g (solidi sospesi secchi)
/mL
Ceppi batterici utilizzati: Escherichia coli PQ 37
Saggio
E' un saggio quantitativo, che si basa sulla lettura spettrofotometrica
dell'assorbanza di due enzimi, la β galattosidasi e la fosfatasi alcalina.
Si utilizza il ceppo di Escherichia coli in fase esponenziale (18-20 ore a 37°C in
agitazione), sospeso in brodo LA-Medium.
Il giorno successivo 100 µl della sospensione batterica vengono diluiti in 5 mL di
LA- Medium ed incubati in agitazione per 2 ore, in modo da ottenere 2x10 8
batteri./mL (A600 =0.2).
Per il saggio si utilizzano una serie di diluizioni scalari del campione in esame.
Si allestisce parallelamente un bianco, costituito dalle varie soluzioni utilizzate
per il saggio più i batteri, ed un controllo positivo scelto fra i mutageni in grado
di provocare una risposta SOS.
Al termine delle 2 ore, 1 mL della sospensione viene ulteriormente diluito in 9
mL di L-Medium.
Si distribuiscono 600 µL della sospensione batterica nelle provette
corrispondenti alle dosi dei campioni e standard. Si incuba per 2 ore a 37°C in
agitazione.
Si divide l'aliquota di soluzione in due serie di provette che serviranno per la
determinazione dei due enzimi in oggetto.
Si aggiungono i tamponi e i cromogeni necessari per la lettura
spettrofotometrica dell'assorbanza dei due enzimi (circa 420 nm). La lettura
deve avvenire nello spazio temporale che intercorre fra 10 e 90 minuti,
effettuando due letture per enzima.
Lettura ed espressione dei risultati
Lettura allo spectrofotometro a 420 nm
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