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Tampone fosfato 0.1 M pH 7.7 ONPG 4 mg/L in tampone fosfato (β galattosidasi) PNPP 4 mg/L in P buffer (fosfatasi alcalina) Procedimento Preparazione campione I campioni in esame dopo setacciatura a 2 mm sono sottoposti a estrazione con una miscela acetone/esano 1:1 in Soxhlet. Gli estratti sono quindi portati a secco e ridisciolti in DMSO in modo da ottenere una concentrazione dei campioni in esame pari a: 6 g (solidi sospesi secchi) /mL Ceppi batterici utilizzati: Escherichia coli PQ 37 Saggio E' un saggio quantitativo, che si basa sulla lettura spettrofotometrica dell'assorbanza di due enzimi, la β galattosidasi e la fosfatasi alcalina. Si utilizza il ceppo di Escherichia coli in fase esponenziale (18-20 ore a 37°C in agitazione), sospeso in brodo LA-Medium. Il giorno successivo 100 µl della sospensione batterica vengono diluiti in 5 mL di LA- Medium ed incubati in agitazione per 2 ore, in modo da ottenere 2x10 8 batteri./mL (A600 =0.2). Per il saggio si utilizzano una serie di diluizioni scalari del campione in esame. Si allestisce parallelamente un bianco, costituito dalle varie soluzioni utilizzate per il saggio più i batteri, ed un controllo positivo scelto fra i mutageni in grado di provocare una risposta SOS. Al termine delle 2 ore, 1 mL della sospensione viene ulteriormente diluito in 9 mL di L-Medium. Si distribuiscono 600 µL della sospensione batterica nelle provette corrispondenti alle dosi dei campioni e standard. Si incuba per 2 ore a 37°C in agitazione. Si divide l'aliquota di soluzione in due serie di provette che serviranno per la determinazione dei due enzimi in oggetto. Si aggiungono i tamponi e i cromogeni necessari per la lettura spettrofotometrica dell'assorbanza dei due enzimi (circa 420 nm). La lettura deve avvenire nello spazio temporale che intercorre fra 10 e 90 minuti, effettuando due letture per enzima. Lettura ed espressione dei risultati Lettura allo spectrofotometro a 420 nm 126
Alla fine delle due letture si calcolano le Unità enzimatiche (UE) UE= 1000 x ∆ A 420 / ∆t Si calcola il rapporto fra le due attività enzimatiche UE β galattosidasi/ UE fosfatasi alcalina. Si calcola il fattore di induzione R dose/ R bianco. Si determina la pendenza della regione lineare della curva dose-risposta (FI/nmol) dove FI = fattore di induzione. Si considera positivo un campione che supera un FI di 2, con un incremento della linearità della retta al crescere della dose testata. Riferimenti bibliografici Miertus, Svorc, Sturdik, and Vojtekova, 1987. Use of specific bacteria for the determination of mutagenic and carcinogenic compounds. Anal.Chem.59, 504-508. Mohn, 1981. Bacterial system for carcinogenicity testing. Mutation Research, 87, 191-210. Nunoshiba, and Nishioka, 1991. Rec-lac test for detecting SOS- inducing activity of environmental genotoxic substances. Mutation Research, 254, 71- 77. Quillardett-Hoffnung, 1985. The SOS chromotest, a colorimetric bacterial assay for genotoxins: procedures. Mutation Research, 147, 65-78. Quillardett-Hoffnung, 1988. The screening, diagnosis and evaluation of genotoxic agents with batteries of bacterial saggios. Mutation Research, 205, 107-118. Roberfroid M. and Rosenkranz H.S., 1986. Short-term assays using bacteria.In: long-term assays for carcinogenens: a critical appraisal. IARC Sci. Publ. Lyon 83, 143-161. 127
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