Kaser EG: Genotyp-Phänotyp-Korrelation beim leichten hereditären ...

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Der Inhalt des Fläschchens wurde mit 1 ml Aquadest aufgelöst, anschließend 15
Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und schließlich durch vorsichtiges
Schwenken gemischt.
Von dem plättchenfrei gewonnenen Probenplasma wurden 5 µl mit 30 µl Mangelplasma
und 15 µl Aquadest automatisch im Analysator gemischt. Mit 150 µl Thromborel ® S
wurde die Gerinnungsaktivierung in vitro gestartet und die FVII-Aktivität durch den Analysator
an der Kalibrationskurve abgelesen.
2.4 Erhebung des Genotyps
2.4.1 Analyse
Mit der molekulargenetischen Diagnostik soll der krankheitsbedingte Nachweis oder
Ausschluss einer kausalen Veränderung der DNA erbracht werden.
2.4.1.1 DNA-Isolation
Die DNA-Isolierung dient dazu, DNA-Moleküle aus biologischem Material möglichst in
reiner Form zu gewinnen. Die Analyse des FVII-Gens erfolgt aus Vollblut. Hierzu wird
EDTA-antikoaguliertes Blut zur Lyse der Erythrozyten mit einem Puffer versetzt und die
zellkernhaltigen Leukozyten werden nach Zentrifugation abpipettiert. Mittels
zugegebener Proteasen und Sodiumdodecylsulfat (SDS) werden Proteine und
Zellbestandteile zerstört und nach Waschung in Ethanol sichtbar ausgefällt.
Anschließend wird die so gewonnene DNA in einer gepufferten Salzlösung
(Elutionspuffer) konserviert. Dieses Verfahren wurde 1988 entwickelt und als „salting
out“-Methode bekannt (Miller et al., 1988; Murken et al., 2003).
2.4.1.2 Polymerase-Kettenreaktion
Die DNA liegt in ihrer ursprünglichen Form als antiparalleler Doppelstrang vor. Die
komplementären Nukleotidstränge werden über Wasserstoffbrücken verbunden und das
DNA-Molekül erhält dadurch eine spiralförmige Tertiärstruktur. Die insgesamt vier
unterschiedlichen Nukleotide bestehen an der Hybridbindung aus den zwei Purinbasen
Adenin (A) und Guanin (G) bzw. deren komplementären Pyrimidinbasen Thymin (T) und
Cytosin (C). Die Basen sind gegenüber der Hybridbindung mit dem Zucker (Pentose)