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Análisis de la expresión de 103 ORFs de función desconocida en S cerevisiae Las diferentes condiciones de cultivo se pueden resumir en el esquema de la figura 3.1. 38 roxl roxó YPGE FY73 30°C/Aóoo^.8 30°C/60min 30°C/24h ^ 1 2 3 4S 30°C/A6oo^.8 A 5 30°C/2h/-SOa(NHa)2 30°C/A6oo^.8 ,^ B^►ccióN 6 ^--- C TTi DNA aiav au^a^ / ` -_ 1/1 ^---^ / \ n 1/ 8. _ 0 30°C/ lh/+NaCI haP^ I 1 \ FY73 30°C/A6oo^.8 36°C/30min 1/2 30°C/A6oo^.8 n 23°C/Aboo^.8 Figura 3.1. Esquema de las 11 condiciones de crecimiento a las cuales fueron sometidas las células de levadura para la extracción posterior de su RNA. • • •
• 3.3. Extracción del RNA: 3.3.1. Condiciones de extracción: MATERIALES Y MÉTODOS La presencia de RNAsa d.isminuye el rendimiento de la extracción; para prevenir este problema se tomaron las ŝiguientes precauciones : El agua y las disoluciones salinas usadas se trataron con dietilpirocarbonato (DEPC) a10,1 %(v/v), se agitaron toda la noche a 37 °C y se esterilizaron en autoclave al día siguiente para eliminar el DEPC remanente. Algnna solución, como el tampón Tris^^^- EDTA^2^, no se trató con DEPC ya que éste modificaría covalentemente los grupos amino que contiene. Se preparó directamente usando agua tratada y reactivos libres de RNAsas. El SDS^3^, que no puede ser autoclavado, se preparó de igual modo. El material de vidrio se esterilizó durante una noche en un horno a 180°C. El material de plástico se enjuagó en cloroformo aclarándolo posteriormente con agua tratada. Se usaron guantes en las operaciones de extracción de RNA, ya que las manos son la mayor fuente de RNasas contaminantes. Todas las operaciones de extracción se realizaron a 4°C. ^'^ Tris-HCI: 2 Amino-2(hidroximetil)-1-3 propanodiol equilibrado con ácido clorhídrico. ^2^ EDTA: Ácido etilenodiaminotetraacético. ^3^ SDS: Dodecil Sulfato Sódico. • 39
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