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Análisis de la expr^esión de 103 ORFs de función desconocida en S. cerevisiae
3.3.2. El protocolo de extracción:
La extracción de RNA se realizó siguiendo un protocolo común
acordado por todos los laboratorios participantes en el consorcio B2
(Lindquist, 1981; Brown, 1995). Las cantidades señaladas se corresponden
con un volumen de cultivo inicial de 400 ml.
a) Se sedimentaron las células, centrifugando a 5.000 rpm durante 5
minutos a 4°C y eliminando el sobrenadante.
b) Se lavó el sedimento en 3,5 ml de tampón de extracción (LiCI 0,1 M,
DTT 0,01 M, Tris-HCl 0,1 M pH 7,5), se centrifugó de nuevo y se
retiró el sobrenadante. En este paso las células pueden conservarse
varios días en un congelador de -80°C sin que el RNA se vea
afectado.
c) Se resuspendió el precipitado en 3,5 ml de tampón de extracción e
inmediatamente se añadió la suspensión celular a un tubo que
contenía 10 g de perlas de vidrio ( 1 mm de diámetro), 0,5 ml de
SDS 10 %, 5 ml de PCIA-1 xRE^' ^ y 2 ml de cloroformo. Con el fin
de romper las células, se agitó vigorosamente y de manera continua
durante 5 minutos en un agitador Vortex. Se volvió a centrifugar
durante 5 minutos a 5.000 rpm, recogiendo la fase acuosa.
(1) El PCIA-1xRE LPhenol-Chloroform-Isoamilic Alcohol) se obtiene mezclando un volumen de
fenol fundido a 65°C con un volumen de cloroformo y dos volúmenes de tampón 1xRE (Tris
O.1M, LiCI O.1M, EDTA 0.1 mM, (3-mercaptoetanol 10 mM, pH 7.4). Se agita vigorosamente
durante varios minutos y se deja en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se separe
completamente la fase acuosa. Se retira ésta por aspiración y se repite el proceso dos o tres
veces más. Tras el úhimo equilibrado se añaden 1/25 volúmenes (8m1) de alcohol isoamílico y
se conserva en la oscuridad a 4°C.
(2) DTT: ditiatreitol.
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