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MATERIALES Y MÉTODOS
para realizar las reacciones de amplificación del DNA. El ordenador define
automáticamente varias características independientes que hay que tener en
cuenta en el momento de elegir el cebador. Estos factores son:
La Tm que el programa determina con la fórmula:
Tm=OH/OS+RIn(C/4)
(OH: variación de entalpía, OS: variación de entropía de formación
del duplex, R: constante de los gases, C: concentración de la
muestra),
La posibilidad de que se formen horquillas en el DNA monohebra.
La estabilidad del duplex molde/cebador.
La autocomplementaridad del cebador.
La presencia de regiones complementarias en los dos cebadores.
Un adecuado diseño de los cebadores asistido por ordenador fué
imprescindible para asegurar que los productos obtenidos mediante PCR
fueran únicos ya que el elevado tamaño de los moldes (DNA genómico 0
procedente de cósmídos con insertos de 30-40 Kb) y la pequeña longitud de
algún oligonucleótido utilizado (13 a 16 nt) potenciaba la aparición de
productos no adecuados y debidos a anillamientos inespecíficos.
Como un control adicional, la especificidad del producto obtenido
mediante PCR se comprobó siempre mediante análisis de restricción; por
tanto en el diseño de los cebadores se tuvo en cuenta que el producto
amplificado incluyese un sitio de reconocimiento para una enzima de
restricción.
En la tabla 3.3 se recopilan los datos del diseño de los cebadores y de
las reacciones de comprobación de las 102 ORFs analizadas. La posición de
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