lie^x - RUC

•
•
•
MATERIALES Y MÉTODOS
3(60 ml de acetato potásico SM; 11,5 ml de ácido acético glacial;
28,5 ml de agua destilada) que se mezclaron por inversión suave del
tubo, incubando otros cinco minutos en hielo. Los tubos se
centrifugaron a 10.000 rpm durante cinco minutos.
c) Como con este procedimiento, además del DNA, se obtiene una
considerable cantidad de RNA; este último se eliminó con un
tratamiento con RNAsa A, a una concentración final de 1 µg/ml,
durante 30 minutos a 37 °C.
d) Para eliminar restos de proteínas que podrían dificultar posteriores
manipulaciones del DNA, el sobrenadante se sometió a una
extracción con igual volumen de PCIA y un posterior lavado con
igual volumen de CIA (cloroformo-alcohol isoamílico en proporción
24:1).
e) A cada muestra se le añadió 10 ml de etanol al 95 %, se incubó
cinco minutos a- 20 °C y posteriormente el DNA se précipitó por
centrifugación a 12.000 rpm durante cinco minutos. Para eliminar
restos de sales, el sedimento se lavó con 10 ml de etanol al 70 % y
se precipitó como en el paso anterior. Las muestras se secaron al
vacío y posteriormente se resuspendieron en 200 µl de 1 xTE.
3.5.2.3. Sondas de ORFs controles:
Diversos plásmidos se usaron en la amplificación por PCR del DNA
correspondiente a una serie de sondas controles relacionadas con genes de
S. cerevisiae de función y regulación conocida:
• pSPACT9 es un subclón del fragmento BamHI/HindIII (1,5 Kb)
del gen ACTl en el plásmido pSP64 (Bettany et al., 1989)
53