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3.6.3. Reacciones de hibridación y lavado:
3.6.3.1. La hibridación:
MATERIALES Y MÉTODOS
Se introdujeron las réplicas en botellas de hibridación (una por botella)
e inmediatamente después de añadirle 15 ml de una mezcla de hibridación
(Na2HP04 0,5 M pH 7,2, SDS 7%, EDTA 1 mM) (Church y Gilbert, 1984), se
dejó prehibridando una hora a 65 °C en un horno de hibridación
(Minihybridisation oven de APPLIGENE).
Una vez terminada la prehibridación, se renovó la mezcla de
hibridación ( 10 ml) y se añadió la sonda marcada (400 µl) cuidadosamente
para que no tocase la membrana antes de que se diluyese en la mezcla de
hibridación. Se dejó hibridando toda una noche a 65 °C. Al día siguiente, por
la mañana, se retiró la solución de hibridación y se procedió al lavado.
Para las hibridaciones con la sonda de rRNA 25S se procedió de la
misma manera excepto que la temperatura de hibridación fue de 45°C.
3.6.3.2. Los lavados:
La membrana se lavó con 20 ml de 2xSSC (NaCI 0,3 M, citrato sódico ^
30 mM) y se dejó unos minutos a 65 °C. A continuación se cambió el 2xSSC
por 30 ml de solución de lavado (SDS 0,1%, 2xSSC) precalentado a 65 °C y
se dejó de 15 a 20 minutos a esa temperatura en el horno de hibridación. Para
la sonda oligonucleotídica de rRNA 25S los lavados se hicieron a 45°C.
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