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MATERIALES Y MÉTODOS
congelador a-20°C. A1 día siguiente se centrifugó a 13.000 rpm durante 20
minutos, se lavó el precipitado con etanol al 70 %, se secó durante 10 minutos
al vacío y se resuspendió en 30 µl de 1xTE.
3.5.4. Análisis de los^roductos de PCR:
Finalizada la PCR, necesitabamos corroborar que el DNA amplificado
se correspondía con el fragmento deseado y medir la concentración de
producto obtenido para poder utilizarlo posteriormente.
3.5.4.1. Análisis de restricción:
Los productos obtenidos por PCR fueron verificados en dos fases. En
una primera etapa se analizó en geles de agarosa el funcionamiento adecuado
de la PCR, comprobando que se obtenía un producto único y de un tamaño
cercano al esperado (datos no mostrados). Una vez conseguidos todos los
productos, se sometieron a los análisis de restricción previstos en la Tabla 3.3.
Los fragmentos de DNA amplificados por PCR se eligieron de tal
forma que todos poseyesen de uno a tres sitios de corte para una endonucleasa
específica, lo que proporciona después de la digestión de dos a cuatro
fragmentos de tamaño conocido; esto nos permitió garantizar que habíamos
obtenido el fragmento esperado. El DNA se digirió con endonucleasas de
restricción de Boehringer-Manheim; para cada enzima se utilizó el tampón
recomendado y suministrado por los proveedores. Las digestiones (1 UE/µg
de DNA en un volumen final de 10µ1) se realizaron durante dos a tres horas a
la temperatura indicada y los productos de la digestión se analizaron en geles
de agarosa o poli-acrilamida según el tamaño de las bandas a detectar:
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