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Análisis de la expresión de 103 ORFs de función desconocida en S. cerevisiae Tabla 3.3. Diseño de los cebadores para las reacciones de amplificación y selección de las enzimas utilizadas en la comprobación de cada producto obtenido Tm: temperatura de melting^, L.P.: Longitud del producto de PCR; L: longitud del cebador. (continuación). , . ^ ^ ' ° N G^ . `N1882" Nombre del Cebador .. N1882.Y5' Posición del Cebador Inicio final , . 3:91860; 39,1845.. SECUENCIA CCGAT,CaCCÁTTAĜGG",T . ;' Tm (°C) . 45,Q L (nt) . 16 L.P. (pb) ^. 30,5 '' E^^a EĉóRl: Longitud Fragmentos (pb) ^ 57^247 ^^ '. N1882 3' .3'91556;' 391571; ' ^AGCTGC,CC.GGTAGAĈ,- . 46„1^ 16 • ^ ^^ ^ ' •' N1888 N1888-5' 393198 393213 GACCCTTCACCTTCCG 44,6 16 332 Xhol 204+127 N1888-3' 393529 393514 TCACCCAAACGCACTT 43 9 16 ^^N189.7.á N1897.5 1897,3'
• 3.5.2. El DNA molde utilizado: MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizó, o bien DNA genómico extraído de la línea FY73 de S. cerevisiae, o bien DNA de diferentes cósmidos ó plásmidos portadores de distintos clones del genoma de la levadura. 3.5.2.1. Obtención del DNA genómico: Para purificar el DNA genómico a gran escala se utilizó él protocolo que comprende los pasos siguientes: a) Se hicieron crecer células de la línea FY73 hasta la fase estacionaria en YPD y se centrifugaron 100 ml de cultivo a 5.000 rpm durante 3 min. b) Se lavó el sedimento con 10 ml de disolución I(sorbitol l^M, EDTA 0,1 M) y se reŝuspendió en 10 ml de disolución II de extracción (Sorbitol 0,9M, EDTA SOmM, NaH2P04 SOmM pH7,5, (3- mercaptoetanol 14 mM). c) Se añadió 0,5 ml de liticasa (5 g/ml) y se agitó suavemente durante 30 min a 30°C. d) Se añadió SDS 1% , se incubó 20 min a 60°C sin agitación y se dejó enfriar a temperatura ambiente. e) Se hicieron 2 ó 3 extracciones sucesivas con 1,5 volumenes de PCIA saturado con tampón 1 xTE (Tris-HC1 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8), agitando suavemente para evitar que se produjesen roturas en el DNA. Las fases se separaron por centrifugación a 5.000 rpm durante 10 min, hasta conseguir una fase acuosa lo más limpia posible de proteínas. _ 51
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