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Análisis de la expresión de 103 ORFs de función desconocida en S cerevisiae
3.6.2. Separación y cuantificación de la incorporación de isótopo:
Para poder valorar la incorporación de isótopo en el DNA, se
prepararon columnas de exclusión con Sephadex G-50 saturado con STE
(Tris-HC1 l OmM pH 7,5, EDTA 0,1 mM, SDS 0,1 %). Una vez empaquetada,
se equilibró la columna con STE, sé añadió el DNA marcado y se
recolectaron 6 fracciones, haciendo pasar por la columna 400 µl de STE para
la primera fracción y luego cinco veces 200 µl de STE para las siguientes. El
isótopo no incorporado se quedó retenido en las columnas.
A continuación, se localizaron las dos fracciones con mayor
incorporación de radioactividad con el sensor de un contador Geiger y se
mezcló el contenido de estos tubos (volumen V1). Luego se tomaron 2 µl
(volumen VZ) de esta mezcla, se añadieron a 10 ml de líquido de centelleo
(cóctel de centelleo biodegradable para muestras acuosas NBCS 104 de
Amersham) y en un contador de radiaciones ^3 (Wallac System 1410 TM liquid
scintillation counter de Pharmacia) se determinaron las cuentas por minuto
(cpm) de cada muestra (actividad A').
Se calculó la actividad específica .de las diferentes sondas usando la
siguiente relación: ^
A.E. (cpm/µg DNA) = A'^cpm) x V i(,µl) x 1000
VZ (µl) x P (ng)
Una incorporación de isótopo adecuada suele dar actividades
específicas comprendidas entre 0,5 y 2x109 cpm/µg DNA.
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