lie^x - RUC

Análisis de la expresión de 103 ORFs de función desconocida en S. cerevisiae
3. 4. Northern blot:
3.4.1. El el de agarosa:
Para preparar el gel de agarosa al 1,5% se pesaron 1,8 g de agarosa y se
mezclaron con 6 ml de tampón 20xMOPS (ácido 3-[N-Morfolino]-propano-
sulfónico 0,2M, acetato sódico 0,05 M pH7, EDTA 0,01 M) y 94 ml de agua
tratada con DEPC. Se disolvió la agarosa en un microondas y se dejó enfriar
en un baño a 65 °C. Justo antes de verterla en la base de la electroforesis, se
añadieron 20 ml de formaldehido (37% v/v) y tras verter, se dejó media hora
en una campana de extracción para eliminar los vapores tóxicos del
formaldehido. ^
3.4.2. Las muestras de RNA:
Se mezclaron 20 µg de RNA (en un volumen final de 7µ1), 12,5 µl de
formamida desionizada, 1,25 µl de Tampón 20xMOPS y 4 µl de
formaldehido (37%). Se desnaturalizó la mezcla, incubando 5 minutos a
65°C, se le añadió 2,5 µl de tampón "azul de carga" (glicerol 50 %(v/v) +
azul de bromofenol 0,25 %(w/v) + xileno cianol 0,25 (w/v)) y se mantuvo en
hielo hasta cargar el gel.
^ 3.4.3. La electroforesis:
La electroforesis se llevó a cabo en una cubeta de electroforesis
(HE100 Supe^ Sub^ Horizontal Unit de Hoefer) que posee un circuito de
refrigeración para evitar la degradación térmica del RNA y un sistema de
42
•
•
•
•