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Análisis de la expresión de 103 ORFs de función desconocida en S. cerevisiae
3.5. Obtención de sondas aor PCR:
La PCR (Polymerase Chai» Reaction) (Mullis y Faloona, 1987) es el
método más efectivo y más rápido para amplificar un DNA diana que se va a
utilizar en cantidades relativamente importantes y cuya especificidad es
imprescindible.
3.5.1. Diseño de los cebadores:
La selección de los cebadores (primers) es particularmente importante
para la especificidad de la amplificación por PCR:
Su tamaño, generalmente próximo a 20 nucleótidos, debe permitir
una hibridación con una secuencia única,
los dos cebadores deben poseer similar Tm (melting temperature o
temperatura de fusión):
Tm =(4 °C x n(G + C)) +(2 °C x n(A + T))
Donde n representa el numero de pares de bases (GC o AT). De
modo que los cebadores tienen que tener un tamaño y un porcentaje
de GC similar.
los oligonucleótidos no pueden presentar ninguna complémentaridad
interna que origine estructuras secundarias, las cuales dificultarían la
hibridación con el molde. Tampoco deben ser complementarios
entre sí.
Una selección exacta, teniendo en cuenta todos estos factores, resulta
pesada y complicada. Afortunadamente la informática alivia esta tarea; el
programa informático OLIGO (National Biosciences Inc. 725 Tower Drive.
Harvard, MN 55340 U.S.A.) permitió seleccionar oligonucleótidos cebadores
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