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Análisis de la expresión de 103 ORFs de funci+ón desconocida en S. cerévisiae
Los niveles absolutos, tanto de las hibridaciones con sondas controles
como con las sondas específicas de las ORFs de función desconocida, se
calcularon usando el nivel de expresión del gen ACTI en la condición de
cultivo nú.naero 2(YPD). ACTI codifica para una proteína, la actina, que
constituye el citoesqueleto de todas las células eucariotas, además está
implicada en los procesos de polarización celular y de endocitosis. Su
expresión se usa habitualmente también como control de carga en los
experimentos de Northern blot; sin embargo en las condiciones probadas en
este trabajo, se comprobó que el nivel de expresión de ACTI decaía
significativamente en las condiciones de cultivo 3(fase estacionaria) y 5
(choque osmótico) y por consiguiente sólo se usó su correspondiente señal en
el medio 2 para calcular los niveles absolutos de cada ORF.
Los genes utilizados como controles de regulación se eligieron porque
presentaban respuestas típicas, caracterizadas previamente por otros
investigadores, en las condiciones de cultivo que se utilizaron en EUROFAN:
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PCKI: se usó como control para la represión por glucosa porque codifica
la fosfoenolpiruvato carboxikinasa, una enzima clave en la
gluconeogenesis (vía metabólica que se activa cuando las células crecen en
ausencia de glucosa con una fuente de carbono como el etanol o el acetato
y que disminuye su actividad en presencia de glucosa). Se conocen tres
niveles de regulación para esta enzima: la inactivación de la enzima
presente en el citoplasma por fosforilación reversible o interconversión
(Burlini et al., 1989), la degradación proteolítica o inactivación por
glucosa (Haarasilta y Oura, 1975; Gancedo y Schwezmann, 1976), y la
represión de la transcripción por glucosa (Haarasilta y Oura, 1975, Yin et
al., 1996). Además, en S cerevisiae, los niveles de mRNA, transcrito a
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