lie^x - RUC

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MATERIALES Y MÉTODOS
La cantidad "P" (en ng) de DNA que iba a ser marcado se calculó
usando la concentración anteriormente estimada (apartado 3.5.4.2.) y se
tomaron 30 ng de DNA. Después de desnaturalizar dos minutos a 100 °C en
14 µl de agua, se añadió 7 µl de la mezcla de reacción, 3 µl de a32P-dATP
(con una actividad específica de 3.000 Ci/mmol) y 1 µl de Klenow (5-10
unidades). Se incubó la reacción a 37 °C durante un mínimo de una hora.
Para rectificar la pequeña heterogeneidad resultante de defectos de
carga del RNA entre los distintos pocillos del gel, se hibridaron
posteriormente los filtros con un control de carga representado por el rRNA
25S. Se sintetizó una sonda oligonucleotídica (5'-CTCCGCTTATT
GATATGC-3') a partir de la secuencia de DNA que codifica el rRNA 25S y
se marcó mediante marcaje terminal con ^y32P-ATP (Lillehaug y Kleppe,
1975).
En este caso se mezclaron en un volumen final de reacción de 15 µl:
- 5-10 pmol del oligonucleótido,
- 1 µl de tampón lOx (Tris-HC1 500 mM, MgC12 100 mM,
EDTA 1 mM, DTT 50 mM, espermidina 1 mM, pH 8,2),
- 1 µl de ^y32PATP,
- 1 µl de Ta -polinucleótido quinasa (Boerhinger Manheim)
Se dejó incubando la reacción a 37°C durante 30 minutos y se añadió
posteriormente a la solución de hibridación.
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