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MATERIALES Y MÉTODOS
La mayor parte de los análisis de restricción mostraron el patrón
adecuado. Sin embargo para 16 ORFs (marcadas con un asterisco en las
figuras 3.5.1. y 3.5.2.), además del producto esperado aparece otra banda, o
bandas mayores inespecíficas. En este caso se rescató de un gel de agarosa la
banda del tamaño adecuado antes de marcar la sonda.
Se presentaron también algunos casos (Figuras 3.5.1. y 3.5.2.) en los
que, aunque el producto es de tamaño adecuado, no se produce la digestión
esperada (N1743, N1888, N1929, N2194 y N1966), o ésta es parcial (G2856,
G2882, G3080, G3193, G3505 y N1773). Esta situación podría interpretarse
debido al hecho de que la región del sitio de restricción para la enzima
utilizada estuviese metilada afectando al patrón de restricción, sin que ello
indicase que el producto obtenido no es correcto. En estos casos, como el
tamaño del fragmento no digerido era correcto y el producto de la PCR único,
se optó por considerarlos adecuados, aunque posteriormente fuese necesario
secuenciar parcialmente estos productos para tener total certeza sobre su
idoneidad.
3.5.4.2. Cuantificación de los niveles de DNA:
Para poder marcar una cantidad definida de sonda en los pasos
siguientes, se necesita averiguar la concentración de DNA resultante de cada
PCR. Para ello se preparó un gel de agarosa al 0,8 % en 1 xTBE (Tris-HC1 90
mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 4 mM, pH 8,3 ) con Bromuro de Etidio
(1 µg/ml) sobre el cual se depositaron gotas de 1 µl del producto de cada PCR
y una gota de 1 µl para cada uno de los siete patrones de concentración
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