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Análisis de la expresión de 103 ORFs de función desconocida en S. cerevisiae de no dar información sobre el tamaño y níunero de transcritos, se adapta a estudios a gran escala, por el menor coste y la rapidez de la información obtenida. Además es compatible con el estudio de la regulación de transcritos abundantes (Mager et al., 1998) pero se comprobó que no tenía sensibilidad suficiente para ser aplicable a las ORFs analizadas en este estudio debido a que son de baja expresión. . La técnica elegida en este trabajo, a pesar de ser pesada y costosa para estudios a gran escala, fue la del Northern blot porque, además de investigar la funcionalidad de las ORFs desconocidas, también es importante determinar el tamaño real de cada transcrito con el fin de comprobar si el tamaño de la secuencia de la ORF estudiada se adecua al de su transcrito y, de este modo confirmar la ausencia de errores durante el proyecto de secuenciación del genoma de la levadura. ^ Para asignar rigurosamente cada transcrito a su respectiva ORF y minimizar las fluctuaciones en la precisión de la señal obtenida, se emplearon como sondas, productos de PCR de tamaño uniforme (alrededor de 300pb) amplificados con cebadores específicos de cada una de las 103 ORFs estudiadas. Se estudió la expresión de las 103 ORFs en distintas condiciones de cultivo, ya que el estudio de su regulación podía aportar algunos datos sobre la función de las proteínas desconocidas. En una primera fase se estudiaron las 52 ORFs del cromosoma XIV en tres condiciones de cultivo: medio rico con glucosa o etanoUglicerol (YPD y YPGE respectivamente) y medio mínimo (YNB) recogiendo las células en la so • • • •
• • • RESULTADOS Y DISCUSIÓN fase temprana de crecimiento exponencial. Dado el escaso número de respuestas reguladoras obtenidas (Lombardia, tesis de licenciatura, 1996), se decidió en una segunda etapa estudiar todas las ORFs en experimentos de transición de unas condiciones a otras. Estos se concretaron cultivando las células bajo 8 condiciones distintas que se describen detalladamente en Materiales y Métodos (apartado 3.2.2. página 36) y que hacen referencia a 5 tipos de regulación (Tabla 4.2.). Tabla 4.2. Descripción de los cinco tipos de regulación estudiada. (1-8 hace referencia a las condiciones descritas en las páginas 36 a 38). Teniendo en cuenta los intereses de investigación particulares de nuestro laboratorio, decidimos incluir 3 condiciones adicionales y externas al proyecto EUROFAN I. Se proyectó así, estudiar el comportamiento de las ORFs desconocidas utilizando tres cepas de S. cerevisiae donde habían sido mutados los genes HAP1, ROXI o ROX6 respectivamente que son genes reguladores de la expresión génica en relación con las condiciones de aerobiosis y anaerobiosis. gi
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• • El presente trabajo: Análi
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• • • ^ 4.4.1.2. ORFs para la
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