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Análisis de la expresión de 103 ORFs de función desconocida en S. cerevisiae
Se enrasó con agua bidestilada estéril para obtener un volumen final de
100 µl y se cubrió con dos gotas de aceite mineral para impedir la
evaporación durante la síntesis. A continuación, se desnaturalizó el DNA
durante 5 minutos a 92 °C, se enfiió en hielo y se le añadieron 2,5 U de Taq
DNA polimerasa cuya temperatura óptima de trabajo es de 72 °C.
Se colocó el tubo con la mezcla en el termociclador, Gene ATAQ
ContYOller de Pharmacia; este instrumento que proporciona automáticamente
variaciones rápidas y cíclicas de temperatura se programó para realizar 30
ciclos de amplificación.
En teoría, después de 20 ciclos, una molécula de DNA se amplifica al
rededor de un millón de veces, pero en la práctica, la amplificación no es
exponencial, especialmente después de 20 ciclos, debido al consumo parcial
de los cebadores y a una cierta desnaturalización térmica de la Taq
polimerasa.
La temperatura de anillamiento se calculó mediante el programa
OLIGO. Todos los oligonucleótidos se seleccionaron de forma que las
condiciones de a.nillamiento fuesen óptimas alrededor de 45-50 °C. A esta
temperatura cerca del 90 % de los cebadores se unen al DNA molde. El paso
siguiente a 72 °C (alargamiento) interrumpe las hibridaciones inespecíficas
accidentales. La duración de la fase de alargamiento (72 °C) en el último ciclo
se extendió a 120 segundos para darle tiempo suficiente a la Taq polimerasa
de finalizar la síntesis de todos los fragmentos.
Finalizada la reacción de PCR, se transfirió la muestra resultante (sin el
aceite mineral) a un tubo Eppendorf, se le añadió 5 µl de Acetato Sódico 3 M,
120 µl de etanol absoluto y se dejó precipitando toda una noche en el
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