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Análisis de la expresión de 103 ORFs de función desconocida en S. cerevisiae
f) Para completar la extracción de proteínas, la fase acuosa se incubó
en hielo con acetato potásico (pH 4,8) durante 2-4 horas en una
proporción 1:5 y se centrifugó 15 min a 10.000 ipm. Se recuperó el
sobrenadante, descartando el posible precipitado que se produce
cuando quedan restos de proteína.
g) Una vez purificado, el DNA genómico se precipitó con 1,5
volúmenes de etanol al 95%, mezclándolo suavemente por inversión
del tubo, hasta que se observó la formación del ovillo típico de DNA
y se centrifugó durante 5 min a 5.000 rpm.
h) El DNA precipitado se lavó una o dos veces con etanol al 70% para
eliminar restos de sales, se secó a vacío durante unos 5 min y se
resuspendió en 1 xTE.
3.5.2.2. Obtención del DNA plasmídico o cosmídico:
El DNA plasmídico o cosmídico se purificó por el método de lisis
alcalina (Sambrook et al., 1989) a partir de transformantes de Escherichia
coli:
s2
a) Se inocularon las células bacterianas en 30 ml de LBA. Tras su
crecimiento, en agitación durante toda la noche a 37 °C, se
centrifugaron las células durante tres minutos a 5.000 rpm.
b) El sedimento se resuspendió en 1,5 ml de solución 1(glucosa
SOmM; EDTA 10 mM; Tris-HC1 25 mM, pH 8) previamente
enfriada en hielo y se incubó cinco minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, se añadieron 3 ml de la solución 2(NaOH 0,2 N;
SDS 1%), se mezcló por inversión dos o tres veces hasta conseguir
una viscosidad homogénea y se mantuvo en hielo durante cinco
minutos. Transcurrido este tiempo se añadieron 2,25 ml de solución
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