Inaktivierung von Proteinen und Zellen durch Laserbestrahlung von ...

Material und Methoden 97
abnehmen. Photobleaching kann die Messungen beeinflussen und muss deshalb
je nach verwendetem Farbstoff berücksichtigt werden.
Die Reproduzier- und Messgenauigkeit wurde anschließend mit dem Enzymassay
der alkalische Phosphatase quantifiziert. Jeweils 50 Tropfen alkalische Phosphatase
mit einem Gesamtvolumen von 1.6 nl (caP = 10 mg/l) wurden 30 min
auf dem Probenträger gehalten. Anschließend wurden 8 nl 4MUP-Substratpuffer
(c = 1 mM) zu jedem Probentropfen hinzugegeben. Die Abbildung 3.31 zeigt die
Fluoreszenz der Proben, die in einem Abstand von 3 min jeweils 5 mal für je 20 s
vermessen wurden.
Zahl der Photonen [s ]
-1
22000
20000
18000
16000
14000
12000
10000
0 180 360 540 720
Abbildung 3.31: Fluoreszenzsignalanstieg durch die Phosphataseaktivität in 6 Tropfen
aus nl-Phosphataselösung mit Substrat aus einem Probenraster. Die Substratfluoreszenz
wurde alle 180 s gemessen.
Die Proben wurden für 20 s ausgelesen, um ein Ausbleichen des Farbstoffs zu
verhindern. Durch die Aktivität der Phosphatase steigt die Fluoreszenz linear
mit der Zeit an, wobei die Steigung ein Maß für die Gesamtenzymaktivität
in der Probe ist. Die Steigungen der einzelnen Proben stimmen überein. Die
Abweichung von maximaler zu minimaler Steigung beträgt 6.1 %. Das Signal-zu-
Rausch-Verhältnis, definiert als das Quantenrauschen innerhalb der 20 s Messzeit
t [s]