Inaktivierung von Proteinen und Zellen durch Laserbestrahlung von ...

Material und Methoden 119
der Zellen betrug in der Zellkultur zwischen 20 und 40%. Die Zellen wurden in
RPMI+ [48] als Medium kultiviert. Vor den Versuchen wurden die Zellen in
Neubauer-Kammern gezählt. Der mittlere Durchmesser der U937-Zellen betrug
5 µm, der der L428-Zellen 8 µm. Die L428-Zellen neigten zu Clusterbildung. Die
Bestrahlung erfolgte mit dem Pikosekunden-Nd:YLF bei 527 nm. Der Strahldurchmesser
entsprach dem, der für die Bestrahlung der chymo-Au-Konjugate
mit Pikosekundenpulsen genutzt wurde. Die Probe wurde kontinuierlich entlang
eines Rasters abgefahren. Die Wendepunkte bei der Bestrahlung lagen außerhalb
der Probe, so dass die gesamte Probe auch an den Rändern gleichmäßig bestrahlt
wurde. Dies ist als Prinzipksizze in Abbildung 3.45 dargestellt.
Laserstrahl
Probentöpfchen
Abbildung 3.45: Scanmuster, das zur Bestrahlung der Zellen eingesetzt wurde.
Der Bestrahlung folgte eine Anfärbung der Zellen mit der lebend/tot-Färbung
[126] über den DNA Farbstoff Probidium-Iodid und das Esterasensubstrat BCECF
(Molecular Probes, USA). Die Proben wurden hierfür nach dem Bestrahlen der
Probentöpfchen in 500 µl PBS in Flowzytometerröhrchen umgesetzt, das die
Farbstoffe PI (1 µM) und BCECF (0.5 µM) enthielt. Die Signalsättigung wurde
nach 15 min Inkubation erreicht. Die Inkubation mit Antikörpern und den
AK-Au-Konjugaten erfolgte für je 30 min. In den ersten Versuchen (Ergebnisse
in Kapitel 4.6.2) wurden Zellen nach der Konjugation in Medium gewaschen.
In Versuchen zur Energieabhängigkeit und den Inkubationsbedingungen wurde
das Gold in den Probentöpfchen belassen, so dass eine Goldkonzentration von
> 1 · 1012 Konjugate/ml in den Proben über die gesamte Versuchsdauer vorlag.