Inaktivierung von Proteinen und Zellen durch Laserbestrahlung von ...

Material und Methoden 107
für α-Chymotrypsin -Konjugate einmalig bei der Etablierung elektronenmikroskopisch
kontrolliert. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigten, dass
die Konjugate mit einem Monolayer der Proteine bedeckt waren. Die charakteristische
Bildung eines losen Pellets der vereinzelten Konjugate in der Zentrifugation
in einem Festwinkelrotor und die Auftrennung vom Clusteranteil [162]
wurde für alle folgenden Ansätze als Maß dafür genommen, dass sich an dem
Clusteranteil in den Proben und der Proteinbelegung nichts im Vergleich zu den
ersten Ansätzen verändert hatte. Elektronenmikroskopisch konnten jedoch auch
nach der Aufreinigung einige Cluster aus 3 bis 5 Partikeln beobachtet werden.
Eine grobe Abschätzung anhand der elektronenmikroskopischen Aufnahmen ergab,
dass der Anteil dieser Cluster unter 10 % der Partikelzahl liegt. Alle für die
Bestrahlung eingesetzten Konjugate wurden direkt vor der Bestrahlung durch
eine Zentrifugation bis 2000 g über 45 min von Clustern befreit.
alkalische Phosphatase -Au
Die Konjugation der Proteine an 15 nm Gold ist nach dem Protokoll von dem
Goldhersteller (British Biocell International) erfolgt [12]. Das Protokoll wurde
für die Kopplung der Enzyme entsprechend dem pI Wert der Enzyme modifiziert.
Alkalische Phosphatase hat seinen isoelektrischen Punkt bei pH 5.8, so dass die
Goldlösung mit K2CO3 und HCl auf diesen pH eingestellt wurde.
Die benötigte Proteinmenge wurde mit Hilfe des beschriebenen Farbumschlags
nach einer NaCl Ausfällung zu 0.1 µg/ml bestimmt. Die Konjugate wurden elektronenmikroskopisch
überprüft, die EM-Präparation ist in Abschnitt 3.5.2 beschrieben.
Es konnte nachgewiesen werden, dass bei der über den Farbumschlag
bestimmten Proteinkonzentration die einzelnen Goldpartikel nicht aggregieren.
Die optimale Proteinkonzentration wurde vor jeder Beschichtung neu bestimmt.
Bei Bindungen, in denen zu wenig Protein eingesetzt wurde, konnte sowohl elektronenmikroskopisch
als auch durch Ultrazentrifugation eine Aggregation eindeutig
nachgewiesen werden. Die Konjugation erfolgt innerhalb von 10 Minuten. Die
Proben wurden anschließend mit 10000 g für 30 min zentrifugiert. Eine weitere
Aufreinigung ist durch zweimaliges Zentrifugieren mit 2000 g für 45 min erfolgt.
Nach der Aufreinigung wurden weniger als 5 % der Probenaktivität durch unkonjugierte
Proteine hervorgerufen. Eine Kopplung mit 80 nm kolloidalem Gold