Inaktivierung von Proteinen und Zellen durch Laserbestrahlung von ...

108 Material und Methoden
ist bei gleichen Bedingungen möglich. Die Konjugate werden im Folgenden als
aP-Au bezeichnet.
Chymotrypsin-Au
Der isoelektrische Punkt von Chymotrypsin liegt bei dem pH 8.8. Entsprechend
wurden in diesem Fall die Konjugationspuffer auf diesen Wert eingestellt. Die
Bestimmung der Konzentration wurde in der NaCl-Ausfällung zu 0.5 µg/ml bestimmt.
Die Aufreinigung wurde analog zur Aufreinigung der alkalische Phosphatase
-Konjugate durchgeführt. Es konnte ebenfalls eine Konjugation mit 80 nm
Gold bei gleicher Vorgehensweise erzielt werden. Die Konjugate werden im Folgenden
als chymo-Au bezeichnet.
MIB-1-Au
MIB-1 (Molekulare Immunologie Borstel 1) [29, 169] ist ein Antikörper gegen
das Kernprotein Ki-67 [62, 61, 169, 53], das spezifisch bei Zellwachstum synthetisiert
wird. Die Konjugation des Antikörpers MIB-1 an 15 nm Gold ist nach
dem Protokoll von dem Goldhersteller British Biocell International erfolgt [12].
Anstatt die Antikörper zu dialysieren, wurde eine stark konzentrierte Proteinstammlösung
verwendet, so dass die Verunreinigung der Gesamtprobe derart
klein gehalten werden konnte, dass Bestandteile des Antikörperlagerungspuffers
die Bindung nicht wesentlich beeinflussten. Die Antikörperkonzentration wurde
vor jeder Konjugation mit der vorhergehend beschriebenen NaCl-Ausfällung
bestimmt. Für die Konjugation wurde die Goldsuspension mit K2CO3 auf den
pH 9.2 eingestellt. Die Proben wurden im Unterschied zu den Enzymproben mit
BSA stabilisiert, da eine Nutzbarkeit über eine langen Zeitraum im Vordergrund
stand. Die Stabilisierung erfolgte, indem nach der ersten Aufreinigung 10 % BSA
zugesetzt wurden. Diese Konzentration wurde für 10 Minuten aufrecht erhalten.
Anschließend wurden die Proben zweifach bei 2000 g in 10 % BSA-Puffer
aufgereinigt, so dass es zu einer weiteren Stabilisierung durch das BSA kommen
konnte. Die Konjugate werden im Folgenden mit MIB1-Au bezeichnet.