Inaktivierung von Proteinen und Zellen durch Laserbestrahlung von ...

Material und Methoden 109
BerH2-Au
BerH2 ist ein Antikörper gegen das Oberflächenantigen CD30, das auch als Ki-1
[171] bekannt ist. Die Konjugation von dem Antikörper BerH2 an das 15 nm
Gold ist analog zu der Konjugation von MIB-1 erfolgt. Die eingesetzte Proteinkonzentration
wurde zu 0.9 mg/ml bestimmt. Diese Konjugate neigen stärker
zur Aggregation als MIB-1-Konjugate.
aP-AK-AK-Au
Die Konjugate für die Versuche zur Abstandsabhängigkeit der Denaturierung
sind erfolgt, indem MIB-1-Goldkonjugate mit einem Ziege-anti-Maus-Antikörper
inkubiert wurden, der kovalent mit alkalischer Phosphatase gekoppelt war (DA-
KO D0486). Die beiden Konjugate wurden 30 min inkubiert, so dass die aP-
Konjugate an die Goldkonjugate binden konnten. Anschließend wurden die Proben
durch Zentrifugieren bei 2000 g (45 min) aufgereinigt. Diese Konjugation
resultierte in Proben, bei denen mindestens eine Antikörperlage zwischen Gold
und Enzym lag. Der maximale Abstand zwischen Gold und Enzym beträgt zwei
Antikörperlagen. Die Konjugate werden im Folgenden mit BerH2-Au bezeichnet.
Elektronenmikroskopie
Elektronenmikroskopisch wurde anhand des Eigenkontrastes von Gold die Integrität
der Partikel überprüft. Mit Hilfe einer Negativkontrastierung konnte
die Proteinhülle um die Goldpartikel sichtbar gemacht werden. Die Negativkontrastierung
beruht darauf, dass die Umgebung der darzustellenden Objekte mit
einer Verbindung inkubiert wird, die stark Elektronen streut, wie z. B. Schwermetall-Salzlösungen.
Wenn die Lösung eintrocknet, bildet sich eine glasartige Schicht,
die von den Abdrucken“ des elektronentransparenten biologischen Materials un-
”
terbrochen wird. An den Kanten des biologischen Materials ändert sich die
Schichtdicke entsprechend den Unregelmäßigkeiten der Objektoberfläche. Diese
Bereiche unterschiedlicher Massendicke streuen die Elektronen unterschiedlich
und erzeugen so den Bildkontrast. Die Proben wurden mit 0.5% Uranylacetat
kontrastiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen wurden in der hohen
Auflösung mit dem EMP10 (Phillips, Holland) aufgenommen. Die Aufnahmen
der geringeren Auflösung wurden mit Zeiss-Gerät EM9 aufgenommen.