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Materiales y Métodos 1. ANIMALES EXPERIMENTALES En la presente Tesis Doctoral se utilizaron ratones machos adultos (2‐3 meses de edad) de tres tipos: 1‐Ratones salvajes (wild type , WT) de la cepa C57BL/6J. 2‐Ratones deficientes de GHSR1a. Se utilizaron animales homocigotas, que se obtuvieron por el cruzamiento entre animales heterocigotas con una base genética C57BL/6J. 2‐Ratones transgénicos CRF‐hrGFP en los que la proteína verde fluorescente humanizada Renilla reniformis (hrGFP) se expresa bajo el control del promotor de CRF. Estos animales se generaron a través del uso de un cromosoma bacteriano artificial de CRF (BAC) que contiene una secuencia upstream del codón de inicio de CRF de aproximadamente 92,64 kb, la secuencia codificante de CRF y una secuencia final de aproximadamente 38,16 kb downstream del codón de terminación. Dentro de éste, se reemplazó la secuencia codificante de CRF por la de hrGFP, en los sitios de inicio transcripcional de CRF. Finalmente, el BAC modificado se microinyectó en el pronúcleo de embriones fertilizados en la etapa unicelular de ratones C57BL/6J. Todos los ratones que se utilizaron se generaron en el bioterio del IMBICE. Los ratones se mantuvieron en cuartos con ciclos de luz‐oscuridad de 12 y 12 hs (de 7:00 hs a 19:00 hs), a temperatura constante (22 ± 1 °C) con libre acceso a agua y alimento balanceado comercial para ratón o dieta común (DC), excepto cuando se indique lo contrario. Los diferentes grupos experimentales se alojaron en jaulas colectivas, con no más de 5 animales por jaula, hasta 3 días antes del experimento correspondiente siendo transferidos en ese momento a jaulas individuales. Los animales se sacrificaron de acuerdo a las normas internacionales aceptadas del “National Institutes of Health” (NIH). Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por 36
Materiales y Métodos la Comisión de Bioterio del Instituto Multidisciplinario de Biología Celular (IMBICE), la cual actúa como comisión de bioética en la utilización de animales. 2. DIETAS UTILIZADAS Se utilizaron en todos los experimentos DC y DRG, provistos por Gepsa (Grupo Pilar, Pilar, Buenos Aires, Argentina, www.gepsa.com). La DC posee un valor energético de 2,5 kcal/gr y su composición es la siguiente: 28,8% de carbohidratos, 25,5% de proteínas, 3,6% de grasas, 27,4% de fibras, 8,1% de minerales y 6,7% de humedad. Por otro lado la composición de la DRG es la siguiente: 22,5% de carbohidratos, 22,8% de proteínas, 21,1% de grasas, 23,0% de fibras, 5,6% de minerales y 5% de humedad. Los principales componentes de la DRG son ácidos monoinsaturados (44,7%), ácidos saturados (29,8%) y ácidos poli‐insaturados (20,9%), entre otros. Es importante remarcar que los pellets de DC y DRG son similares en su apariencia general (color, textura etc.). 3. REACTIVOS − 3‐3’‐diaminobenzidina (DAB)/ solución de Níquel (Sigma Aldrich, cat# 32750). − Alcoholes (Biopack). − Antagonista del receptor Ox 1, SB‐334867 (Tocris, cat.# 1960). − Anticuerpo Alexa‐594 donkey anti‐goat (Molecular Probes, cat#A11058) − Anticuerpo anti‐c‐Fos generado en conejo (Calbiochem/Oncogene PC38 lot. 45133). − Anticuerpo anti‐c‐Fos generado en conejo (Santa Cruz CS7202). − Anticuerpo anti‐conejo biotinilado (Jackson Immuno Research Laboratories, cat. 711‐ 065‐152). 37
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