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Materiales y Métodos − Ingesta de DRG durante exposiciones múltiples: Durante la mañana de 4 días consecutivos se les dio a los ratones acceso libre por 2 hs a DRG (n=6) luego de las cuales los animales se perfundieron. Se controló la ingesta durante la exposición a DRG. − Retiro de DRG: En este experimento se dio a los ratones, libre acceso a DRG durante todo el día por 2 semanas. Luego se separaron en 2 grupos, a uno de ellos se lo alimentó con DC (n=3) y al otro con DRG por 24 hs. Posteriormente se perfundieron. − Aversión condicionada a DRG: En las mañanas del primer y segundo día experimental, los ratones se expusieron por 2 hs a DRG ad‐lib y luego inyectados con LiCl (150mM, 12ml/kg, ip., n=6) o salina (n=3). En el tercer día, los ratones se expusieron nuevamente a 2 hs de DRG y luego se perfundieron. 5. CIRUGÍAS ESTEREOTÁXICAS Todas las cirugías se realizaron en el cuarto de cirugía del bioterio del IMBICE, con material de cirugía adecuado y en las condiciones de asepsia normalmente requeridas. En todos los casos se utilizaron animales anestesiados con una mezcla de Ketamina (150mg/Kg de peso i.p) y Xilacina (15mg/Kg de peso i.p). 6. ANALISIS NEUROANATOMICO 6.1 Perfusión y preparación de muestras de cerebro Para realizar la fijación de las muestras de cerebro, se perfundieron los animales con formaldehido al 4% como fijador. Para ello, los animales se sujetaron anestesiados a una mesa de cirugía por las extremidades con el abdomen hacia arriba. Luego, se abrió la cavidad torácica con el objetivo de acceder al corazón. Se conectó el sistema de perfusión directamente al ventrículo izquierdo del corazón con una aguja. Luego, se realizó una incisión en la aurícula 46
Materiales y Métodos derecha para permitir el escape de la circulación de retorno de los líquidos de lavado. Previo al pasaje del fijador, se pasó a través del sistema de perfusión una solución de lavado (PBS 0,01 M pH 7,4 conteniendo 10 UI/ml de heparina) a un flujo de 5 ml/minuto durante 2 minutos. Luego, se comenzó el pasaje de fijador, formaldehido al 4%, durante 10 minutos a un flujo de 5 ml/minuto. Luego de la perfusión, se aislaron los cerebros y se post‐fijaron en solución de formaldehido al 4% durante 2 horas y finalmente se criopreservaron mediante la incubación en una solución de sacarosa al 20% durante toda la noche. Al día siguiente, se congelaron los cerebros y se cortaron en secciones coronales de 32 μm de espesor utilizando un crióstato. 6.2 Inmunohistoquímicas y tinciones Todas las IHQs se realizaron sobre secciones coronales de cerebro en flotación. Luego de cada IHQ se montaron las secciones secuencialmente en portaobjetos de vidrio, y se colocó el cubreobjetos con medio de montaje (Bálsamo de Canadá en el caso de IHQ cromogénica y solución de montaje para fluorescencia) para finalmente observarlas al microscopio. Se realizaron controles para todas las IHQ, en los cuales se procesaron secciones de cerebro con los mismos protocolos que se describen a continuación para cada caso en particular, pero sin el agregado de anticuerpo primario o sin anticuerpo secundario. 6.2.1. IHQ cromogénica simple Primero se lavaron las secciones coronales 3 veces durante 10 minutos cada una con PBS, luego se incubaron en H 2 O 2 al 0,5% en PBS durante 30 minutos. Luego de otros tres lavados, se realizó una incubación en solución bloqueante (3% suero normal de burro y 0,25% TritonX en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente para luego realizar la incubación de las secciones coronales con el anticuerpo primario correspondiente. Luego, se realizaron otros tres lavados, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario 47
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