UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA

Materiales y Métodos
correspondiente de acuerdo al anticuerpo primario utilizado, se lavaron e incubaron
durante 1 hora con el complejo avidina‐peroxidasa biotinilada (kit Vectastain Elite ABC).
Finalmente se revelaron con el sustrato 3,3’‐diaminobencidina comercial en presencia o
ausencia de Níquel de acuerdo a la IHQ realizada, generando un precipitado negro‐violeta
o marrón, respectivamente. Los anticuerpos primarios y secundarios se detallan en la
Tabla 1
6.2.2 IHQ cromogénica doble (c‐Fos/orexina o TH)
Luego de realizar una IHQ simple contra c‐Fos revelada con DAB/níquel, las secciones de
cerebro se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con el segundo anticuerpo primario. Luego
del tiempo de incubación correspondiente al anticuerpo utilizado, se lavaron las secciones y se
incubaron con el anticuerpo secundario por 1 hora. Posteriormente, las secciones se lavaron, se
incubaron por una hora con el kit avidina–biotina–peroxidasa y finalmente la señal visible se
reveló con DAB sin solución de níquel (Tabla 1)
6.2.3 IHQ simple contra orexina y doble contra TH y orexina dentro del AVT
Secciones cerebrales conteniendo el AVT se usaron para la detección de señal
inmunoreactiva para orexina usando el anticuerpo anti‐orexina y se reveló la señal con
DAB/Níquel obteniendo un precipitado negro/violáceo como se indicó anteriormente.
Secciones cerebrales independientes conteniendo el AVT se usaron en primer lugar para
la detección de células inmunoreactivas para TH. Se obtuvo un precipitado marrón al revelarlo
con DAB sin solución de níquel y luego se continuó incubando las mismas secciones cerebrales
con el anticuerpo anti‐ orexina. Esta IHQ se reveló con DAB/ Níquel dando una señal
negro/violácea.
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