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Materiales y Métodos − − − − − − − Anticuerpo anti‐conejo biotinilado (Vector BA1000). Anticuerpo anti‐conejo conjugado a Alexa 594 (Invitrogen A21207 lot. 52958A). Anticuerpo anti‐CRF (Santa Cruz. no. A‐6455, lot 71B1). Anticuerpo anti‐orexina generado en conejo (Phoenix Pharmaceuticals, cat# H‐003‐30). Anticuerpo anti‐ratón biotinilado (Vector Laboratories, cat# BA‐9200). Anticuerpo anti‐ TH generado en conejo (Santa Cruz H196). Anticuerpo anti‐TH generado en ratón (Sigma‐Aldrich, cat# T2928). − Anticuerpo policlonal anti‐hrGFP generado en ratón (Stratagene Vitality cat# 240142). − − Bálsamo de Canadá (Biopack). Buffer fosfato salino (PBS, del inglés, phosphate buffered saline) 0,01 M PH 7,4: Na 2 HPO4 1,9 g, NaH 2 PO4 0,32 g y NaCl 8,16 g/l.(Biopack). − Colchicina (Sigma‐Aldrich C2580000) − DABCO (Sigma lot. 95H3458). − DMSO (Merk K45190152 402). − − − − − Fluoesferas (Red Fluorescent, Invitrogen cat.# F8793). Formaldehido (Biopack). Ghrelina esterificada con ácido n‐octanoico (Global Peptide, cat. PI‐G‐03). Heparina (Calciparine. Sanofi Aventis). Kit comercial de complejo avidina‐ biotina‐peroxidasa “VectaStain Elite ABC” (Vector Laboratories, PK‐6200). − LiCl (Sigma‐Aldrich 746460). − − LPS (Sigma‐Aldrich, cat. # L‐3755). Sacarosa (Biopack). − Suero Normal de Burro (Equitech‐Bio.INC lote SD 30‐2090). 38
Materiales y Métodos − − Tionina (Sigma, cat. T7029). TritónX.(Biopack) 4. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 4.1 Estudio de los circuitos neuronales involucrados y del rol de ghrelina en el control de un único evento de ingesta de DRG En la mañana del día experimental (9.00 am), ratones alimentados ad‐lib con DC se expusieron a un pellet de DC o DRG por 2 hs (n=16 y 14, respectivamente). Para poder discriminar los efectos potenciales de la DRG en sí misma de aquellos producidos por la elevada ingesta de la misma, se incluyó un grupo control pair‐fed que consistió en ratones expuestos a una cantidad de DRG similar a la consumida por los animales expuestos a DC (n=10). Se controló la ingesta total en las 2 hs de exposición a las correspondientes dietas. Luego los ratones se perfundieron, se extrajeron los cerebros y se cortaron en secciones coronales para realizar distintas inmunohistoquímicas (IHQs) 4.1.1 Bloqueo de la acción de orexina En otro experimento, se usó el antagonista del receptor Ox1, SB‐334867, para bloquear la vía de señalización de orexina. Este compuesto se llevó a 100mM en DMSO conteniendo HCl ( en una concentración de 100mM), y se inyectó intraperitonealmente (ip) en una dosis de 5µg/gr de peso corporal en 200 µl de salina, a las 8:30 am. Se ha observado que dosis similares de SB‐ 334867 han afectado el consumo de DRG en varios modelos animales, mientras que no afecta el consumo de DC disponible. Treinta minutos después de la inyección con vehículo o SB‐334867, los ratones alimentados ad‐lib con DC, se expusieron a un pellet de DRG por 2 hs (n=10 y 8, respectivamente). Se incluyó un grupo control pair fed para distinguir los efectos específicos del SB‐334867 (n=9), que consistió en ratones inyectados con vehículo y expuestos a una cantidad 39
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