UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA

Materiales y Métodos
derecha para permitir el escape de la circulación de retorno de los líquidos de lavado. Previo al
pasaje del fijador, se pasó a través del sistema de perfusión una solución de lavado (PBS 0,01 M
pH 7,4 conteniendo 10 UI/ml de heparina) a un flujo de 5 ml/minuto durante 2 minutos. Luego,
se comenzó el pasaje de fijador, formaldehido al 4%, durante 10 minutos a un flujo de 5
ml/minuto. Luego de la perfusión, se aislaron los cerebros y se post‐fijaron en solución de
formaldehido al 4% durante 2 horas y finalmente se criopreservaron mediante la incubación en
una solución de sacarosa al 20% durante toda la noche. Al día siguiente, se congelaron los
cerebros y se cortaron en secciones coronales de 32 μm de espesor utilizando un crióstato.
6.2 Inmunohistoquímicas y tinciones
Todas las IHQs se realizaron sobre secciones coronales de cerebro en flotación.
Luego de cada IHQ se montaron las secciones secuencialmente en portaobjetos de vidrio, y se
colocó el cubreobjetos con medio de montaje (Bálsamo de Canadá en el caso de IHQ
cromogénica y solución de montaje para fluorescencia) para finalmente observarlas al
microscopio.
Se realizaron controles para todas las IHQ, en los cuales se procesaron secciones de
cerebro con los mismos protocolos que se describen a continuación para cada caso en particular,
pero sin el agregado de anticuerpo primario o sin anticuerpo secundario.
6.2.1. IHQ cromogénica simple
Primero se lavaron las secciones coronales 3 veces durante 10 minutos cada una con PBS,
luego se incubaron en H 2 O 2 al 0,5% en PBS durante 30 minutos. Luego de otros tres lavados, se
realizó una incubación en solución bloqueante (3% suero normal de burro y 0,25% TritonX en
PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente para luego realizar la incubación de las secciones
coronales con el anticuerpo primario correspondiente. Luego, se realizaron otros tres lavados,
se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario
47